第二节　选择：耐药性进化的机制

人们普遍认为细菌耐药性是使用抗生素的直接选择后果，但实际上在临床用药之前，细菌耐药性就已经存在（表6-3）。

一、波动的抗生素环境

波动的抗生素环境比不变的环境更可能促进耐药微生物朝向更高的自适应峰值进化。在自然界，尤其是在医院环境中，含有β-内酰胺酶的细菌会同时或连续遇到不同的β-内酰胺分子的选择压力。体外实验中，将带有blaTEM-1基因的大肠埃希菌置于波动浓度的头孢他啶和阿莫西林环境中，发现所有变异株的突变都在自然产生的β-内酰胺酶中检出过。然而，将细菌置于单独头孢他啶环境中，可发现一些从未在天然的TEM型β-内酰胺酶中检出过的突变。此结果支持在医院分离的自然产生的广谱TEM变异株是由几个β-内酰胺的波动选择压力造成的，不是由单一抗生素选择出来的。

二、抗生素的选择作用

（一）抗生素的低浓度选择

本来敏感的细菌在接触抗生素后会大量死亡，此时细菌的自发性变异可以增加，选择过程产生了大量突变体，有的可以抵抗很低浓度的抗生素。用抗生素敏感性试验检测这些突变体，结果与完全“敏感”的菌株没有区别，因为抗生素在血清中的峰值浓度远远超过抑制这些变异体的浓度。然而，结合对新出现的耐药性细菌作遗传和种群的分析，如对含ESBLs的肠杆菌科或对β-内酰胺类抗生素耐药的肺炎链球菌分析表明，在治疗期间已经选择出低水平的耐药性变异株，而且低水平变异株又经过新的突变在选择周期之后进化为高水平的耐药微生物。

对微生物耐药性进化的讨论中出现了三种观念，第一个观念认为对抗生素“耐药”是指微生物对一种药物的最低抑菌浓度（MIC）有所增加，按照这个概念“较小的”增加毫无意义，因为患者仍然可以用超过这个MIC值的抗生素浓度成功地治疗；第二个是派生的观念，即“显著高浓度的抗生素才适用于耐药性的选择”。因为环境中的天然微生物释放的抗生素很少，其选择作用可被忽略；第三个观念是耐药基因仅与高水平耐药性有关，这与第一个观念是密切相关的。特定抗生素提供了对细菌特定耐药变种的选择，有此效果的抗生素浓度被指定为“选择性抗生素浓度”。

（二）抗生素的梯度选择

治疗过程中使用任何剂量的抗生素都可形成高度多样性的浓度梯度，浓度梯度的形成与药代动力学因素有关，如抗生素对不同组织有不同扩散速率，或在不同的身体部位有不同的消除速率。产生抗生素钝化酶的正常或致病性菌群也影响药物梯度的形成。人体内的细菌种群在每次给药之后可能要面对一个大跨度的抗生素浓度梯度。由于微生物种群的自发遗传变异能提供大量的可供选择的变异亚群，恰好适合于确定哪个抗生素浓度能够选择出哪个特殊的抗药性亚种群。

理论上说，每个有明确MIC的特定变异种群，都有被特定浓度的抗生素选择富集的可能，这将有助于更好地理解和研究对抗生素耐药性细菌的种群进化。细菌种群显示自然遗传的多态性，对于许多抗生素来说，自发的基因变异容易导致大量低水平耐药，较特异的高水平耐药并不常见。从某种程度上看，在现实世界中，抗生素的浓度大多位于低水平，MIC值小幅度增加的种群将被这些抗生素优先选择。首先，大多数细菌经过多重剂量的几轮连续治疗，在抗生素浓度的选择中将产生对低水平变异株的一个渐进性富集过程。富集的细菌数一旦达到临界值时可能出现新的变异株，然后在选择性抗生素浓度中可被进一步选择，从而提高了抗生素的耐药水平。另一方面，当低水平耐药变异株到达一定水平时，在富含抗生素的培养基中允许整合外源性的耐药基因。总之，通过对细菌种群选择放大过程的研究表明，浓度梯度上的不同浓度可能具有不同的选择特异性。抑制敏感菌群的抗生素浓度和抑制耐药菌群的抗生素浓度之间的浓度才是选择性抗生素浓度，低于或高于这个浓度范围均不具有选择作用。专家们提出更有效的预防产生耐药性的方法，是使用超越“预防突变浓度”的抗生素剂量进行治疗，以避免选择出耐药突变株。

三、抗菌药物的选择窗口和选择倾向

（一）选择窗口

选择窗理论的中心思想是抗菌药物浓度特异性选择，是在最低抑菌浓度（MIC）和 防耐药突变选择浓度（mutant prevention concentration，MPC）之间的抗生素浓度，即为耐药菌株的选择窗口，在MIC和MPC这个浓度区间易于选出耐药菌，所以用药时应力求使药物浓度在MPC以上。抗生素的选择性浓度是指最敏感菌群（而不是变异菌群）的最低抑菌浓度（在当地条件下）以上的抗生素浓度。如果抗生素浓度比敏感株和变异株两个菌群的MICs都高，则无法选择出变异株。同样的，如果抗生素浓度比敏感株和变异株两个菌群的MICs都低，也无法产生选择作用。因此，对一个特定变异株的选择作用可能发生在一个非常狭窄的药物浓度范围内，这种选择只能在称为“选择窗口”的特定抗生素浓度下发生。 耐药突变选择窗（mutant selection window，MSW）就是以MPC为上界，MIC为下界的浓度范围。传统的药效学理论认为在抗菌药物浓度低于MIC时会导致耐药；而MSW理论认为，当药物浓度低于MIC时，由于药物浓度较低而未作用于耐药突变菌群，因此不会产生耐药，但也不能达到预期的治疗目的。当药物浓度高于MPC时，由于病原菌必须同时产生两种或两种以上耐药突变才能生长，因此也不可能产生耐药。只有当药物浓度在MIC和MPC之间时，耐药突变菌株才被选择性扩增。防突变浓度（MPC）和突变选择窗（MSW）两个新概念的提出为耐药机制研究开辟了新的领域，我们可以通过调整用药策略，以关闭或尽量缩小突变选择窗口，这是减少病原菌耐药的一条新的思路。

那些进化到能水解头孢噻肟的高效TEM-β-内酰胺酶与其早期的分子只有几个氨基酸的差异。TEM-1 β-内酰胺酶是这些多重变异体的祖先，很大可能这些变异体是通过连续的点突变和对单一突变中间体的不断选择而来。每个突变将赋予超出祖先菌株的选择优势。TEM-1酶的单一突变菌株（如TEM-12，在164位由精氨酸置换丝氨酸）仅表现出对头孢噻肟耐药性的非常小的增变。产生TEM-1的大肠埃希菌可被0.008µg/m头孢噻肟抑制，而产生TEM-12的大肠埃希菌可被0.015µg/ml头孢噻肟抑制。尽管如此小的表型差异，含TEM-12的菌株能被头孢噻肟高效选择出来，并为形成具有双重突变的更有效的酶（如TEM-10）提供了遗传背景。

（二）选择倾向多重耐药性：“基因资本主义”

“ 基因资本主义（genetic capitalism）”的概念最近被应用于多重耐药的病原体，是指微生物通过突变或基因捕获等机制进一步积累耐药机制的可能性。“基因资本主义”反映出耐药机制丰富的细菌会获得更加丰富的耐药机制，如在最近几年里耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、耐万古霉素的肠球菌或产生ESBL的肠杆菌科等的不同变异株的出现说明了这一概念。显然，在环境中微生物经常面临着不同抗菌药物的选择，那些具有较多耐药特点的微生物具有更多被选择出的可能性，单一抗生素也能选择出多重耐药菌株（图6-2）。此外，获得耐药性基因，甚至获得毒性特征，可能会提高克隆的适应度，促使其获取越来越多的适应性优势。赋予细菌对四环素（tet）、大环内酯类（erm）、β-内酰胺类（bla）、氨基糖苷类抗生素（aac、aad aph）、磺胺类（sul）和甲氧苄啶（dfr）等耐药的基因，在各种环境分离的细菌中广泛存在。某些情况下，这些耐药基因（如磺胺类和链霉素）的持续存在无法用抗生素的选择压力来解释，因为这些抗菌药物已很少使用，然而伴随出现的其他耐药性基因可能驱动这个选择过程，可以解释这一矛盾。此外，整合子、转座子、或质粒等也有利于这些耐药基因在无选择力的情况下存留。

多重耐药性的出现是连续捕获抗菌药物耐药决定子（如突变或基因转移）和细菌在不同抗菌药物选择压力下选择的耐药性。