第三节　应激对细菌的影响

细菌包括病原菌在内在自然环境中经常会面临一系列的应激，例如营养受限或营养饥饿导致的营养应激（nutrient stress）、活性氧或者活性氮分子引起的氧化应激/亚硝化应激（oxidative/nitrosative stress）、包膜破坏导致的包膜应激（envelope stress）、温度变化引起的热应激（heat stress）以及核糖体断裂引起的核糖体应激（ribosomal stress）等。这些应激不但能引起细菌的生理学变化，包括代谢途径的改变，可能会产生新的代谢产物；使细菌细胞数目发生变化，偏离起典型生长曲线；也可能会引起细菌形状的改变，甚至细胞结构的改变，甚至能引起细菌对抗菌剂敏感性的变化。 应激反应（bacterial stress responses）是指机体（这里是指细菌）在受到各种内外环境因素刺激时所出现的非特异性全身反应。本节将简述几种重要的应激对细菌的影响。

一、营养应激

1.营养应激下细菌生理学的变化

细菌在营养受限或营养饥饿导致的营养应激下可发生一系列变化，如外部形态的改变，通常会变为圆形，长时间营养受限会使细胞体积达到最小值。但细菌仍在分裂，仍在进行缓慢的代谢活动。此外，营养应激也可引起细菌覆盖物的变化，如胞质膜的结构改变，脂质双层中的脂肪酸变得更具有流动性和不可穿透性，膜磷脂降解可作为能源和碳源。细胞壁也发生了结构的变化，这可能会增加细菌抵抗自溶的能力。如大肠埃希菌在饥饿状态下，细胞内亚细胞组分的体积和性质发生改变，如胞质浓缩、周质间隙的体积变大，DNA和RNA含量会减少，核糖体降解。随着形态学的变化，增加了细菌在营养应激下的耐受性，由于磷脂成分或肽聚糖的交联发生改变，出现对乙醇的耐受，如饥饿期的细菌能抵抗一定浓度的乙醇，而此浓度足以杀死在对数生长期的细菌。

2.营养应激下细菌代谢组学的变化

当外界营养物质耗尽时，细菌转向内源性营养，消耗体内的能量贮藏物质或其他细胞成分，饥饿时自体细胞内成分的利用可通过内源性代谢的本底水平显示出来。细胞保持低能量的内在要求，以及保持与低能量要求相符合的低代谢速率的能力，是维持饥饿期内源性代谢本底水平的两个决定因素。

（1）利用储备性多聚糖：

当环境中出现碳源匮乏时，某些细胞可快速利用储备糖原或聚β-羟基丁酸（PHB）。在维持细胞活性的同时提高饥饿耐受性，对其饥饿初期的耐受性与细胞所储备的PHB含量直接相关，细胞如能储备较多的PHB，将比在同一环境中无储备物的细胞有更强的耐受饥饿的能力。当碳源缺乏时，细胞提高捕获基质的酶的浓度、改变中间产物的代谢途径、诱导对碳的高亲和力的吸收或调动代谢潜能以利用其他营养物质。

（2）核糖核酸（RNA）的快速降解：

细胞内的RNA的含量与细菌的生长速率成正比，饥饿初期细菌的存活也与RNA的含量成正比。饥饿时RNA等大分子被很快降解。尤其是核糖体RNA（rRNA）会被优先降解。核糖核酸酶（RNase）在饥饿时的活性可提高数倍，RNase可将70SrRNA单体降解为30S和50S两个亚基，核糖体亚基被分解成核苷酸和蛋白质，这种蛋白质的功能与膜有关。在这种情况下，RNA的含量和降解速度与细菌的饥饿存活能力相关。

细菌在缺乏氨基酸的情况下，合成核糖体及RNA等会停止，这种应急反应叫 严谨反应（stringent response）。这是一种全局性基因调控系统，位于核糖体A位上的无负载的tRNA是这一调控系统的开关。当氨基酸饥饿时，严谨因子（relA基因的表达产物）的表达增加，此因子在核糖体蛋白L11和tRNA（TФC区）的参与下合成四磷酸鸟嘌呤核苷（ppGpp）积累。ppGpp的作用呈多效性，具有广泛的生理效应，但主要是与RNA聚合酶结合，改变RNA聚合酶的结构，影响启动能力。此外，ppGpp尚能抑制rRNA合成，不同程度的抑制参与tRNA、mRNA、核糖体蛋白、蛋白质合成所需要的蛋白因子的合成；能活化某些氨基酸操纵子的表达，抑制与氨基酸转运无关的转运系统；活化蛋白水解酶等，达到节省能源、帮助细胞度过饥饿时期。

（3）蛋白质的降解：

饥饿时与细菌生长期有关的蛋白质被逐渐降解，使细胞内蛋白质的净含量也在减少。如大肠埃希菌在饥饿时首先发生RNA的降解，之后则发生蛋白质的降解，但有些细菌的RNA降解和蛋白质降解可同时发生。蛋白质降解后产生的氨基酸可作为一种能源，有些氨基酸也可在饥饿时为使细菌存活而用来合成一种新的蛋白质。

3.营养应激下细菌耐药的变化

细菌的营养应激是自然界的一种普遍现象。当应用抗生素治疗时，尤其是应用抗生素的早期，细菌生长受到抑制，这本身就是一种应激条件，与营养饥饿过程相类似，能使细菌的基因表达和代谢发生改变，出现应激蛋白质的合成。在这种状态下，某些针对性基因也会发生改变，产生抗生素的耐药性。例如阻遏肽聚糖和磷酸的合成，从而引起细菌对青霉素的耐药性。青霉素以及其他β-内酰胺类抗生素的作用靶位是一组位于细菌表面的青霉素结合蛋白（penicillin bining protein，PBP），具有催化酶作用，可参与细菌细胞壁的合成，维持形态和糖肽结构的调整等。β-内酰胺类抗生素与其靶位PBP结合后，可干扰肽聚糖的正常合成，导致细菌死亡。几乎所有的细菌都含有PBP，一种细菌通常含有4～8种PBP，某些革兰阳性菌（如肺炎链球菌）和革兰阴性菌（如铜绿假单胞菌，淋病奈瑟菌等）能改变其PBP的结构，是细菌产生β-内酰胺耐药性的机制之一。

另外，肽聚糖水解酶和聚合酶活性与磷脂合成专性偶联，而β-内酰胺抗生素能使肽聚糖水解酶解偶联，引起溶菌作用。当氨基酸饥饿所引发的严谨反应，严谨因子的高表达致使ppGpp积累，阻遏了细菌胞质膜磷脂的合成，同时也阻遏了肽聚糖聚合酶和水解酶的活性，所以引起细菌的耐药性。此外，外部环境可对细菌的耐药性产生影响。缺镁会导致铜绿假单胞菌对阳离子药物如多黏菌素耐药；缺铁会导致大肠埃希菌对β-内酰胺类耐药。最近又有研究表明缺磷将使大肠埃希菌对氟喹诺酮类耐药；氨基酸缺乏将导致大肠埃希菌对氟喹诺酮和阿米西林的耐药；若同时缺乏氨基酸和葡萄糖将使大肠埃希菌对氧氟沙星和阿米西林的耐受性更为持久。以上压力因素均可改变细菌对抗菌药物的灵敏度。抗菌药物本身亦可激发细菌的保护性应激机制，如氟喹诺酮类和氨基糖苷类药物可破坏细菌核糖体的翻译，阻断DNA表达，进而激活保护性应激机制。因此，对细菌饥饿存活及耐药性的研究将有助于耐药机制的研究和指导临床合理用药。

二、氧化应激/亚硝化应激

氧化应激是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物；亚硝化应激是一种氧化应激。绝大多数的耐药决定因子及其调控蛋白均会受到氧化和硝化的压力作用。例如在大肠埃希菌及其他肠杆菌科调节超氧化应激机制的关键应激调节因子SoxRS（最初被称为超氧反应双重调节系统（TCS）。除菌剂作为普遍的氧化物，可直接激活SoxRS控制的基因的表达。而SoxRS可以调控RND家族（细菌外排系统四大组成家族之一）的acrAB-TolC多药外排系统，该系统是保护性应激机制的重要组成部分。在此外排系统中，acrAB基因的表达可被SoxS调控，而外排系统的突变可导致SoxS的表达持续升高，进而acrAB的表达量增加，最终导致细菌耐药性的增强。而在铜绿假单胞菌中存在另外一种多药外排系统调节因子-mexAB-oprM多药外排系统的操纵子mexR，可对氧化作用产生应激。此外，像细胞外信号分子——吲哚、多胺等都会影响细菌中活性氧簇（ROS）的形成。

三、细菌包膜应激

外部环境中的不利因素可以影响细菌包膜（包括细胞壁和细胞膜）的结构和功能，在此条件下，包膜（这里指革兰阴性杆菌）的保护应激机制得到激活，通透性发生改变，进而影响细菌的耐药性。包膜压力保护性应激机制受细胞外液高渗应激调节因子RpoE调控。RpoE是肠道致病菌中重要的σ（sigma）因子，能启动许多基因的表达。多种抗菌药物以细菌包膜的组成成分作为作用靶点，也可以穿过细胞膜寻求胞内靶点。RpoE与细菌的耐药性有关。鼠伤寒沙门菌中RpoE功能的改变可使菌株对抗微生物肽（CAP）敏感。在大肠埃希菌中，RpoE因子可以负调控phoPQTCS，使细菌内的脂多糖得到修饰，最终使菌株对CAP的耐药性增强。

此外，包膜保护性应激反应亦受algU基因编码的ALgUsigma因子调控，该因子可提高MexCD-OprJ的表达，功能类似于大肠埃希菌中的RpoE，在铜绿假单胞菌中，MexCD-OprJ高度表达于nfcX突变的多重耐药菌株中，其代谢物可提高长链脂肪酸的含量水平，而外排通道系统可输出长链脂肪酸。因此，在包膜应激条件下，外排通道系统所扮演的角色是使膜质交换和包膜结构的重新架构，但algU在膜损害抗菌药物存在的条件下可提高MexCD-OprJ表达的作用机制仍然不明确。

四、热应激

细菌在热应激状态下以基因表达变化为特征的防御适应反应。热应激时新合成或者合称增多的蛋白成为热休克蛋白，由热休克基因编码。在大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌中，氨基糖苷类药物可诱导热休克基因突变。以铜绿假单胞菌为例，在氨基糖苷类、妥布霉素和热休克条件下，Lon蛋白酶（Lon蛋白酶是一种在各种生物体内广泛分布并且具有多种生物功能的蛋白质，是一种天然抗氧化剂）可诱导热休克蛋白的表达。值得注意的是，在工具菌株中，Lon蛋白酶的过度表达对菌株耐氨基糖苷类有着显著影响，热休克应激机制（产生热休克蛋白）可以保护细菌避免氨基糖苷类的杀伤作用。有研究表明，对鲍曼不动杆菌进行为时30min的45℃预培养比37℃的预培养更能使菌株耐受氨基糖苷类的作用。

此外，氨基糖苷类和热休克之间显然存在着某种关系，即热休克蛋白可以被错误翻译的畸形多肽片段为靶点，而这种畸形的多肽片段是由因氨基糖苷类作用而破裂的核糖体翻译产生。与此相一致的是，畸形的多肽片段的清除会减弱抗菌药物对细菌的毒性。热休克应激机制可增强铜绿假单胞菌对碳氢霉烯类药物和β-内酰胺类耐受性，细菌产生畸形多肽的机制还不清楚。

总之，多种应激都可增强细菌对抗菌药物的耐药性。而这种压力应激途径也可作为抗菌药物作用的靶点。因此，对细菌保护性应激机制的研究可以帮助研究者选择更有效且稳定的抗感染治疗方式，对医院感染的控制与预防具有重要意义。

（杨淑凤）