第二节　细菌的遗传物质

细菌的遗传物质是DNA，DNA靠其构成的特定基因携带并传递遗传信息。细菌的基因组是指染色体和染色体以外遗传物质所携带基因的总称，染色体外的遗传物质包括质粒DNA、噬菌体和转座子等；真菌的遗传物质包括染色体DNA、线粒体基因（mtDNA）、质粒、转座因子等；病毒分为DNA病毒和RNA病毒两大类，故病毒的遗传物质除DNA外还有RNA。

一、染色体

细菌染色体（bacterial chromosome）是一条环状双螺旋DNA长链，按一定构型反复回旋形成松散的网状结构，附着在横隔中介体或细胞膜上，细菌染色体携带绝大部分的遗传信息决定了细菌的基因型。与真核细胞的染色体比较，细菌染色体是裸露的核酸分子或与少量特殊蛋白质结合，缺乏组蛋白，无核膜包裹。细菌基因组中的基因结构是连续的，其排列紧密。几乎无内含子。

以大肠埃希菌（K12）为例，染色体长约1300µm，近似为菌体长度的1000倍，在菌体内高度盘旋缠绕成丝团状。染色体DNA的分子量为3×109左右，序列分析证明为4640kbp，约含4288个基因。细菌染色体DNA的复制，在大肠埃希菌已证明是双螺旋复制，完成复制全过程约需20min。

自1995年首次完成流感嗜血杆菌的全基因组DNA测序以来，大部分重要微生物的代表株均已完成了测序。全基因组序列分析的资料表明细菌的种内和种间存在着广泛的遗传物质交换，如耐药性基因和致病岛的获得。细菌染色体上带有编码耐药性的基因，其来源可能是产生抗生素的微生物，但因有耐药性也来自细菌的看家基因，如其编码产物在长期进化过程中变为抗生素的灭活酶（如氨基糖苷类修饰酶）。

染色体发生基因突变也可使细菌获得耐药性。耐药性自然突变率为10-10～10-7，由突变产生的耐药性是随机的，一般只对一种或两种相类似的药物耐药。基因突变所获得的耐药性比较稳定，但在大量菌群中，产生耐药的菌株是极个别的，而且生长较慢，对理化因素的抵抗力可能不及敏感菌，因此自然界中的耐药菌仅居次要地位。基因突变在耐药性发展上具有重要意义。如超产广谱β-内酰胺酶的革兰阴性菌，多耐药结核分枝杆菌等均与基因突变密切相关。

另外，革兰阴性菌（如大肠埃希菌、淋病奈瑟菌）对喹诺酮类耐药与编码解旋酶A亚基的基因突变有关，而阳性菌（如金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌等）对喹诺酮类耐药主要与编码DNA拓扑异构酶Ⅳ的基因突变密切相关。细菌对大环内酯类药物的抗性与细菌核糖体50S亚基发生基因突变相关。

二、质粒

（一）质粒的分类与特征

1.分类

质粒（plasmid）是细菌染色体以外的遗传物质，是环状闭合的双DNA，存在于细胞质中，具有自主复制的能力，所携带的遗传信息能赋予宿主菌某些生物学性状，根据质粒基因编码的生物学性状可分类为：①致育质粒：或称 F质粒（fertility plasmid），带有F质粒的细菌为雄性菌，具有性菌毛；无F质粒的细菌为雌性菌，无性菌毛。②耐药性质粒：编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性。耐药性质粒分为两类，其中可以通过细菌间的接合方式进行基因传递的称接合性耐药质粒，又称 R质粒（resistance plasmid）；另一类则不能通过接合进行传递的称非接合性耐药质粒，但此基因可通过噬菌体等传递。③毒力质粒或 Vi质粒（virulence plasmid）编码与该菌致病性有关的毒力因子。④细菌素质粒编码各种细菌产生的细菌素，如Col质粒（coliciogenic plasmid）编码大肠埃希菌产生的大肠菌素。⑤代谢质粒编码产生与代谢相关的许多酶类。

2.质粒

质粒具有自我复制的能力，一个质粒是一个复制子（replicon），在菌体内可复制，产生其拷贝（copy）。拷贝数低，如F质粒只有1～2个，这种质粒的复制往往与染色体的复制同步，称为 紧密型质粒（stringent plasmid）；拷贝数高，为10～60个或更多，可随时复制，与染色体的复制不相关，称 松弛型质粒（relaxed plasmid），一般小质粒拷贝数高。质粒DNA所编码的基因产物能赋予细菌某些性状特征，如致育性、耐药性、致病性和某些生化特性等。质粒可自行丢失与消除，随着质粒的丢失与消除，质粒所赋予细菌的性状亦随之消失，但细菌仍存活。质粒可通过接合、转化或转导等方式在细菌间转移。接合性质粒带有与接合传递相关的基因（tra等），质粒较大，一般为40～100kbp，如F质粒和多数的R质粒，可通过接合方式传递。非接合性质粒较小，一般在15kbp以下，如大肠菌素质粒ColE1，不能通过接合方式进行传递，但在一定条件下通过与之共存的接合性质粒（如F质粒）的诱动（mobilization）或通过转导性噬菌体而传递（图1-9）。

两种结构相似密切相关的质粒不能稳定共存于一个宿菌的现象称为质粒的不相容性（incompatibility），是由质粒间具有相同或相似的复制及分配调控机制所决定的。反之，几种不同的质粒同时共存于一个菌内则称相容性，这是由质粒复制时对宿主菌的依赖程度决定的。不同质粒在复制时所需的复制酶、在菌体中的复制部位等均不产生竞争抑制，故可相容。

（二）耐药性质粒（resistance plasmid）

可存在于革兰阳性和阴性菌中，由耐药传递因子（resistance transfor factor，RTF）和耐药决定因子（resistance determinant factor，RDF）两部分构成。前者能编码性菌毛，决定自主复制与接合转移；后者能赋予宿主菌耐药性，它含有多个转座子（Tn）或耐药基因盒（resistance gene cassettes），构成一个多耐药基因的复合体，这是造成细菌多重耐药的原因（图1-10）。

目前，多重耐药的沙门菌、志贺菌、变形杆菌、阴沟肠杆菌等革兰阴性杆菌已大量存在于人和动物肠道中，大肠埃希菌比其他致病菌更易接受R质粒，已成为人和动物体内耐药基因的储存库。R质粒不仅在同一种属细菌间转移，而且可在不同种属细菌间相互传递，造成耐药性的广泛传播。带有多个耐药基因的R质粒转移，导致多重耐药的肠道杆菌日益增加，给临床治疗带来很大困难。

三、噬菌体

噬菌体（bacteriophage或phage）是感染细菌、放线菌和螺旋体等原核生物的病毒，只能在活的宿主菌内复制增殖。噬菌体的遗传物质不仅随着它的感染可在宿主菌之间及宿主菌与噬菌体之间传递，而且还能赋予宿主菌某些生物学性状。噬菌体具有病毒的特性，个体微小，需用电子显微镜观察，无细胞结构，是由头部与尾部组成，头部由蛋白质衣壳包绕核酸组成，呈六边形立体对称。尾部与头部靠尾须、尾领相连，接着是管状的尾髓与外被的尾鞘，终止于尾板，尾板上有吸附细菌表面的尾刺与尾丝（图1-11）。

噬菌体感染细菌是由尾部与相应细菌细胞表面的受体特异结合，噬菌体基因进入菌体内并以前噬菌体形式整合在细菌染色体上，随着细菌的分裂而将噬菌体基因传代至子代，这种不增殖、不裂解细菌的状态为溶原状态，形成溶原状态的噬菌体为 溶原性噬菌体（lysogenic phage）或温和噬菌体（temperate phage）。前噬菌体可偶尔自发地（发生率为10-5）或在某些理化或生物因素的诱导下脱离宿主菌染色体而进入溶菌周期导致细菌裂解，并产生新的成熟的噬菌体去感染其他细菌。有些温和噬菌体可使溶原性细菌的表型发生改变，如当白喉棒状杆菌感染了β棒状杆菌噬菌体时可产生白喉毒素，称为 溶原性转换（lysogenic conversion）。同样，肉毒梭菌产生肉毒毒素，化脓性链球菌产生红疹毒素等，都是因这些细菌感染了相应的温和噬菌体。另如沙门菌、志贺菌等的抗原结构和血清型的改变也受温和噬菌体的控制。

此外，当前噬菌体从细菌染色体上脱离时可能携带宿主菌的某些基因片段，形成噬菌体感染另一细菌时，有可能将原宿主菌的一段基因传递给新感染菌。这种通过噬菌体的感染而将甲菌的基因片段转给乙菌的方式称为转导（transduction），而噬菌体本身的基因转给宿主菌的传递方式可转移比转化方式更大的DNA片段，而且由于包装在噬菌体的蛋白质衣壳中，可免受DNA酶降解，故DNA转移效率高。但因噬菌体有特异性，故转导所介导的耐药性仅能发生在同种细菌内。转导是金黄色葡萄球菌转移耐药性的重要方式，如该菌对青霉素G耐药的主要机制是质粒介导的青霉素酶，但此类R质粒并非由RTF传递，而是由噬菌体的转导方式转移至敏感菌中。金黄色葡萄球菌对其他β-内酰胺类抗生素、氯霉素、四环素和红霉素等的耐药基因，也可以是由噬菌体为媒介传递给敏感菌。另外，转座子和整合子也可经溶原性噬菌体这一载体转移。

四、转座子和整合子

染色体基因插入耐药质粒的频率和耐药基因的可移动性仅用转化和转导机制难以解释，因这些机制所致的基因重组常发生于具有高度同源性的DNA区域之中，对于同源性低或非同源性基因间的基因转移与重组，尚有其他基因转移元件（如转座子和整合子）的参与。转座子是基因组DNA中的可移动元件，含有编码转座酶（transposase）的基因，其两端具有反向重复序列（inverted repeat，IR），具有特异定点插入功能。转座子的中心序列常有编码耐药性、毒力等基因。借助IR的特异定位作用介导这些基因的水平转移。

（一）转座子

转座子（transposon，Tn）是一类基因组中可独立移动的DNA片段，可在细菌的染色体、质粒或噬菌体之间自行移动（插入或切离）的遗传成分，是一段特异的具有转位特性的核苷酸序列，故又称为 跳跃基因（jumping genes）或移动基因（movable genes）。最早发现的Tn是在R质粒上带有抗药基因的Tn。Tn不能像质粒那样独立复制，必须要依附在染色体、质粒或噬菌体上与之同时复制。Tn在质粒之间、质粒与染色体之间、噬菌体与染色体之间的转移现象称为转座。伴随着Tn的转位过程，内源性的Tn会出现插入突变，外源性的Tn则出现基因的转移与重组。因此，转座子在赋予细菌生物学性状改变和促进细菌进化的作用不可忽视。根据转座子的基因大小和所携带基因的性质等，将Tn分类如下。

1.插入序列（insertion sequence，IS）

为最简单的或序列较短的转座子，长度不超过2kbp，相当于1～2个基因的编码量，一般只编码一种参与转位作用的转位酶，即不携带任何已知与插入功能无关的基因区域，往往是IS与插入点附近的序列共同起作用（图1-12）。IS存在于多种细菌的染色体或质粒中，可能是细菌正常代谢的调节开关之一；也能介导F质粒通过同源性重组插入到细菌的染色体上，成为高频重组菌株；也可作为某些噬菌体基因中的正常组分。

2.转座子（Tn）

Tn是一类除携带与转座作用有关的基因外，还携带其他特殊功能基因（如耐药基因、重金属抗性基因、糖发酵基因、肠毒素基因、结构基因等）的转座子，序列长度一般超过2kbp（2000～8000bp），其结构分为两部分，即两侧臂的末端反向重复序列和中心序列。末端重复序列能为整合酶所识别，与插入功能相关。中心序列带有遗传信息，包含3个主要的功能基因：①tnpA基因：负责编码转座酶（整合酶），该酶能特异识别Tn及其受体靶位点两端的DNA序列，使Tn与靶位点序列交错接合；②tnpR基因：其编码产物具有解离酶和抑制tnpA与tnpR转录的阻遏蛋白的功能；③结构基因：决定细菌的耐药性和某些毒力因子，通常带一种或多种耐药性基因、重金属抗性基因、肠毒素基因（表1-1）。根据结构特征的不同，转座子可分为复合转座子（complex Tn），Tn3系转座子和接合转座子。

（1）复合型转座子：

其两侧臂末端就是IS序列或类IS序列，中间连接着一个编码抗生素抗性基因（图1-13）。IS可以是反向重复的构型，也可以是同向重复的构型。很容易将携带的耐药基因在细菌的染色体、质粒和噬菌体基因组之间转移，导致耐药基因的播散，这种转位作用是自然界中细菌耐药性产生的重要原因之一。

（2）Tn3系转座子：

其两侧臂末端与复合型转座子不同的是没有IS或类IS组件。但它们在性质和结构上非常相似，均由3个部分组成，两侧末端是30～40bp的正向或反向的重复序列（IR），中央区是与Tn功能有关的基因和抗生素抗性基因。如Tn3系转座子中的Tn3的长度约为5000bp，两侧末端是38bp的IR序列，中心区域有3个基因。一个是编码对氨苄西林耐药的β-内酰胺酶基因，另外两个是与转位作用相关的TnpA和TnpR基因，编码的蛋白质具有两种功能，一种是抑制TnpA基因的合成活性，另一种是促进在中央分离区发生位点特异的切割（图1-14）。

（3）接合型转座子：

是在革兰阳性球菌（肠球菌）的染色体上发现的一类可以在细菌间以接合方式转位的转座子，通常整合在细菌基因组中，转移时首先自行剪切形成一个不能复制的环状中间体，整合到载体质粒上，然后经接合方式转移至受体菌。其代表是Tn916。它们没有末端IR序列，也不产生同向重复。

Tn插入某一基因时可引起基因发生突变，同时在插入部位又引入一个或多个耐药基因，使细菌产生耐药性或多重耐药性。Tn携带的耐药基因在细菌染色体和质粒之间或质粒和质粒之间发生转移，且不需碱基对同源就能插入，故宿主范围广泛，可导致耐药性基因在革兰阴性菌和革兰阳性菌之间转移和播散（表1-1）。

（二）整合子和基因盒

整合子由5′端的核心区和3′端的结构基因区组成，核心区编码DNA整合酶，并包括重组位点的短序列；结构基因区包括1个或多个基因盒的中心序列，通过整合子的整合酶催化，以插入形式存在于整合子中，并通过整合子上的启动子作用得以表达，故又称基因盒-整合子系统。

1.基因盒（gene cassettes）

其结构由位于5′末端的一个基因和位于3′末端的一个有位点特异性的59碱基单元（59 base element，59 be）组成，能被整合子编码的DNA整合酶识别和催化，特异地结合于整合子上，并通过整合子上启动子的作用得以表达。基因盒的基因多为抗菌药物耐药基因，许多耐药基因（编码氨基糖苷类、β-内酰胺类、氯霉素、TMP等）包含在可移动的基因盒中。一个整合子可捕获1个或多个基因盒，被捕获的基因盒5′-端与attⅠ结合。尽管每个基因盒59be的交换位点从57到141个碱基不等，但59be的5′端与基因盒基因编码区3′反向核心序列RYYYAAC为界，3′端则与核心序列（GTTRRRY）为界，中间为含有1个60bp的共同序列的不完全的反向重复序列（图1-15）。这种59be结构为基因盒的插入及基因盒的功能表达提供了重要的结构基础，因为耐药基因盒可以从一个整合子转移到另一个整合子上，使整合子中耐药基因不断积累，成为多耐药整合子。基因盒的起始密码子位于盒的一端，通常不含启动子，但可从整合子的一个共同启动子Pant开始表达。耐药基因的表达水平受启动子变异和基因盒插入部分的影响。

2.整合子（integron）介导耐药

整合子是细菌捕获外源性基因并使之转变为自身功能性基因的一种基因表达单位，是通过转座子和接合质粒在细菌之间进行传播的遗传物质。整合子大小为800～3900bp，5′端为高度保守的核心区，是编码DNA整合酶的基因（int），并包括2个重组位点（attI和attC）。Int位于整合子的5′-保守末端，属于酪氨酸整合酶家族，整合酶负责催化基因盒在attI 和attC上的整合和切除。

整合子主要由编码整合酶基因（int1）、基因重组位点、启动子和耐药基因盒组成，即基因盒-整合子系统，目前分为四类：Ⅰ类整合子是最常见的一类，在大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、弗氏枸橼酸杆菌和铜绿假单胞菌等革兰阴性杆菌以及革兰阳性棒状杆菌中存在；Ⅱ类整合子位于转座子Tn7及其衍生物上，其整合酶基因与Ⅰ类整合基因有46%同源性；Ⅲ类整合子与碳青霉烯类耐药有密切的相关性；Ⅳ类整合子是在霍乱弧菌基因组中发现的，其整合酶基因与Ⅰ类整合基因有45.5%的同源性，因其含有179个基因盒而被称为超级整合子（super integron），除含有耐药基因外，还含有编码毒素、血凝素和脂蛋白的致病基因。整合子能捕获外源性基因，尤其是抗生素耐药基因，并通过整合子的位点特异性基因重组机制，将多种耐药基因组装在一起，使其耐药基因（基因盒）发生扩散（图1-16）。

3.整合子、基因盒的转移与表达

整合子的移动包括两层意思，一是整合子在质粒、转座子、染色体之间的移动；二是整合子可特异性捕获或切除基因盒，导致基因盒的移动。同一基因盒可整合于不同的整盒子上，一般线形的基因盒被切割下来，由于基因两端的特殊结构可相互连接，故游离的基因盒以闭合环状结构存在，通过整合酶IntI催化，以线状结构结合于特异的交换位点attI 和attC（59be位点），这种形式为特异性整合。特异性整合是可逆的。少数游离的基因盒也可由IntI催化，但它不结合于attI 和attC特异位点上，而是结合于整盒子的非attI-attC 或attC-attC交换位点（第2位点）上。这种形式为非特异性整合。非特异性整合是不可逆的。细菌一旦非特异性地整合上基因盒，就使其永久性获得新基因，这对基因盒在细菌间的传播以及细菌质粒和基因组的进化有重要意义。

由于大多数基因盒都不含有启动子，故基因盒的表达须依赖于整合子上的启动子。当线状基因盒整合于位点attI上，包括多个基因盒在内，只存在一种方向（5′→3′）排列，这种位向特异性有利于启动子带动所有下游的基因盒的表达。5′-保守末端区的Pant是主要启动子，少数整合子在其下游位置尚有P2启动子，属强启动子。当Pant为弱变异体时，则P2就成为基因盒表达的主要启动子。基因盒表达除依赖启动子的强弱外，尚与插入的基因盒靠近启动子的距离有关，即最靠近启动子的基因盒的表达水平最强，而下游的基因盒表达水平逐渐减弱。如果基因盒整合在第2位点（非特异整合）基因盒的表达须依赖于整合子上适当方向的启动子。极少数基因盒自身含有启动子和翻译弱化信号，如与氯霉素耐药性有关的CmlA基因盒，在亚抑制浓度的氯霉素诱导下，自身启动子可致CmlA表达。由于大多数基因盒都是耐药基因，1个整合子可捕获多个基因盒，因此可表达出对不同抗菌药物的多重耐药性；而且基因盒、整合子属于可移动基因元件，可位于细菌的质粒或染色体上，对耐药性在细菌间传播产生影响。

目前已鉴定出60多种抗生素耐药基因盒可整合到整合子中，许多临床分离菌株都带有整合子，以致在革兰阴性杆菌中约有43%的细菌含有Ⅰ型整合子，可表现出对氨基糖苷类、喹诺酮类及第三代头孢菌素类药物的耐药性，也易介导多重耐药性。整合子常存在于临床耐药菌株质粒和转座子上，能在不同细菌间转移，而自然界中包括人体正常菌群肯定存在一个相当大的抗生素耐药基因库，细菌复制子及其宿主菌之间的“基因流”很可能是经常性的而非偶然的，当病原菌暴露于强大的抗生素选择压力下，这个基因库随时对细菌开放，使细菌迅速摄取耐药基因并获得耐药性。