一、涂片镜检和分离培养鉴定

(一)涂片镜检法
1.痰标本收集策略的研究
印度Chandra等 [1]在1537名患者中,收集就诊当天间隔一小时的两份痰标本以及次日晨痰标本,同步进行标准抗酸染色法(Ziehl-Neelsen,ZN)以及改良ZN法镜检。前者阳性率为9.8%,比后者高0.37%。研究认为就诊当天间隔一小时的两份痰标本可用于改良式ZN染色镜检对肺结核的诊断。与此相反,印度学者Nayak等 [2]收集了2012年10月到2013年3月的2251位成人疑似结核患者就诊当天间隔1小时的两个痰标本以及次日晨痰标本,涂片后用金胺O染色,LED荧光显微镜镜检。研究表明尽管LED荧光显微镜镜检法对于菌量少的标本检出敏感率更高,但其对同一天的痰标本检测可造成8%的涂片阳性率的流失。因此研究者建议应谨慎对待WHO推荐的仅在就诊当天留取痰标本的新政策。
2.肺外标本的检测
中国学者Huang等 [3]评估了MODS法对中国人群中肺外结核患者标本检测。样本包括胸腔积液(N=112)和脑脊液(N=61),检测结果显示MODS对两类标本检测的灵敏度分别为20.5%、37.5%,特异度近似100%。培养的中位数时间分别为14、9天。研究者认为与L-J培养相比,MODS法大大缩短了报告时间,在资源有限的国家和地区开展此类标本检测对提高肺外结核的诊断有显著帮助。张继萍等 [4]为探讨纤维支气管镜肺泡灌洗液改良抗酸染色法对痰菌阴性肺结核患者的诊断价值,对50例痰菌阴性肺结核患者进行纤维支气管镜肺泡灌洗,应用传统、改良两种抗酸染色法对灌洗液进行检测,得到两种方法对肺结核诊断的阳性率分别为38%和82%。研究者认为改良抗酸染色法大大提高了痰菌阴性肺结核患者的阳性诊断率,值得临床推广应用。
3.新技术与涂片镜检的联合应用
传统抗酸染色的痰涂片镜检法的检出界限为每毫升痰液标本中含菌量最低10 4个菌,尽管荧光染料如金胺O等能够提高其检出率,但培养阳性的痰标本仍有一半以上涂片检测结果为阴性。Ryan等 [5]评价了新型的与核酸结合的荧光染料SYBR® Gold对体外培养的Mtb涂片镜检的方法。能够检测出有氧状态下及厌氧状态下培养的99%的Mtb,而常规金胺O,金胺-若丹明染色检出率在54%~86%范围内。尽管SYBR® Gold由于成本和稳定性的原因,目前尚无法在临床标本中检测应用,但随着相关研究的展开,未来仍有希望被应用于临床。美国学者McCall等 [6]将新型微型物镜与数字化荧光涂片镜检技术相结合,评价其与标准的荧光痰涂片镜检。研究证明两者有着较高的一致性,前者的敏感性和特异性分别为100%、95%。
(二)分离培养和鉴定
李辉等 [7]综述了液体培养法在结核病及耐药结核病诊断中的应用,强调了其中实验室质量控制的重要性。提出应参照国家结核病参比实验室参照WHO 推荐的方法对Mtb培养制定的质量控制程序而编写的《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》,对于常规结核病实验室培养的质量控制有两个参考指标,一定时期内的污染率和涂阳培阴率,培养污染率应控制在2%~5%;针对初治结核病患者的涂阳培阴率应控制在10%内。若培养污染率小于2%,表明该实验室在分离培养前期去污染过程分枝杆菌被杀灭太多,存在过度处理的问题;若污染率大于5%,又表明去污染不充分杂菌没有被杀灭,前处理不够。但通常液体培养污染率要高于固体培养,对于液体培养更加要防止操作过程的污染。涂阳培阴率若高于10%,则表明该实验室涂片显微镜检查质量有问题或培养技术达不到要求。泰国Phunpae等 [8]介绍了一种通过培养法快速鉴定Mtb的方法,利用酶联免疫吸附测定(ELISA)在临床标本液体培养的滤液中检测Mtb分泌抗原Ag85。该方法与标准培养鉴定相比敏感性为89.6%,特异性为94%。使用该方法可最早在第3天检测到,第3天、第1周、第2周和第4周分别诊断出了25%、50%、80%和90%的TB患者。