第七章　哮喘表型与内型研究进展

支气管哮喘是以可逆性气道阻塞及气道高反应性为特征的慢性气道炎症性疾患，已成为全球范围内严重威胁公众健康的一种常见慢性疾病，其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，据世界卫生组织估计全球哮喘患者人数到2025年将达4亿人。其发病机制复杂多样，病理生理改变、临床表现和对治疗的反应具有多样性，表现出明显的异质性，因此需要对每一群患者进行区分。但现有的哮喘分类主要依据是疾病病因、疾病的控制水平与严重程度，常常不能很好地反映哮喘的异质性。因此2009版的哮喘防治指南（GINA）首次将“表型（Phenotypes）”的定义引入，并提出基于表型的分类有助于指导治疗及判断预后。

一、支气管哮喘表型

表型是机体的可观察特征，是遗传因素和环境因素相互作用的结果，可将生物体分为不同类群。哮喘的表型是描述临床和形态特征以及对治疗的反应，与临床表现、触发因素和治疗反应相关，与基本的发病机制不相关联。1918年Rackemann提出最初的哮喘表型，即外源性哮喘和内源性哮喘，该研究为以单变量区分哮喘表型研究的开始，但由于过于笼统，对治疗指导意义不大。2006年Simpson等提出基于诱导痰炎性细胞类型区分哮喘的炎症表型，将哮喘分为嗜酸性粒细胞型、中性粒细胞型、混合细胞型和少细胞型四类，这些表型与哮喘的发病机制、治疗反应和预后等相关，对哮喘治疗有很高的指导意义。但由于痰炎性介质和细胞随着时间的推移表现出不稳定性，而且不能使用单一诱导痰可靠地确定一个持续性哮喘表型，此外，还考虑到时间和成本问题部分医疗机构不愿意频繁诱导痰液分析，这些原因在很大程度上限制了痰液分析在临床实践中的运用。2007年美国心肺和血液病研究所基于哮喘相关的生理学参数，如气流阻塞程度或缓解药使用情况等用单变量区分哮喘表型，并写入“美国哮喘诊治指南”。该表型的提出对当时哮喘教育和管理，尤其是促进糖皮质激素的吸入起到积极的作用，但没有对其分子机制进行研究。

近年来，学者们对哮喘的表现和治疗反应的异质性认识不断加深，从哮喘的不同角度进行观察并归纳出多种临床和炎症表型。大量可观察的临床特征被用于描述哮喘的表型（图1-7-1），其中多数与症状和严重程度的差异相关，而不与根本的发病机制差异相关联。同时关于哮喘表型的描述受主观性和较差连贯性的制约，而且单变量区分哮喘表型不能全面反映哮喘的病情及其对治疗的反复等情况。因此需要一个结合哮喘多方面因素的强大系统，来确定与疾病模式一致的分组，这有助于鉴别和预测对特定治疗的反应，同时也有助于集中当前遗传和分子生物学研究为具有特殊病理生理异常的不同表型提供了一个框架。

聚类分析是一组多元的数学算法，具有两种不同的功能：①在特定变量的基础上，量化个体与群体的相似性；②对个体进行分群，使得同一群内个体之间的相似性强，而不同群个体之间的相似性弱。其主要优点是客观性，同时利用包括假设多变量相等权重的方法学，有助于减少偏倚。Haldar等首先采用k-means聚类法对3个独立的哮喘人群进行哮喘表型研究，根据其研究结果（见彩图1-7-2）认为聚类分析提供了一种新的多维方法识别临床治疗反应差异的哮喘表型，有助于指导临床治疗，并为探索性的分子和遗传研究提供可靠的框架。但其研究仍有一些局限性，首先运用公式将人群区分为不同的集群可能不太现实；其次在变量的选择及每一人群集群的数量上存在主观性；此外没有探究特定集群与已知的致病因素（如鼻息肉和阿司匹林的敏感性）之间的可能关联。此后Moore等采用系统聚类分析进行哮喘表型的研究，运用34个变量对726例哮喘患者进行分析，区分出5种哮喘表型，并指出80%的受试者可以用3个变量（支气管扩张剂前后的FEV1%预计值、哮喘发病年龄）来区分哮喘表型。该研究与Haldar等的研究相比，样本量更大，聚类变量更多，所得临床表型分类体现了哮喘的异质性，并显示出表型之间病理、生理差异，但还需进一步的研究评估该聚类分析前瞻性地对疾病的严重程度进行分类和通过个性化的哮喘管理及识别具有不良后果的个体改善哮喘控制的能力。Haldar和Moore等应用聚类分析对哮喘表型进行区分，被认为是哮喘表型分类的正确方向，这些研究引发了如何解决临床异质性的思考。

二、支气管哮喘内型

虽然哮喘表型分组涉及个体相似的可观察的特征，并以根本的分子机制或治疗反应为基础，但目前研究认为在哮喘表型的基础上治疗哮喘是欠佳的。为寻求更佳的治疗策略，认为哮喘内型是哮喘个体化治疗的基石，且已在一些依据内型制定特定治疗的临床试验中取得满意的疗效。

内型是基于独特的发病机制的疾病亚型，是疾病个体化治疗的基础，是对表型的深入研究和支撑，是运用受累组织、体液中的分子标志对疾病进行亚类分析。一种适当的内型除包括发展成固定性气流阻塞或其他后果的可能性外，还应包括疾病复杂的本质特征。研究哮喘内型有以下四方面意义：首先在进行流行病学调查时能更好地确定哮喘相关的发病率、患病率、病残率、病死率、公共卫生资源利用情况；其次在遗传学研究中，与基因相关的内型可导致更特异的联系；再次在药物临床试验中，依照内型为基础所做的结论能帮助日后识别哪些病人可以从现存或新的治疗方法中受益；最后可以预测内型分层治疗可优化个体治疗方案，给可以获益的人群使用特异的药物减少医疗支出。哮喘的表型与内型密切相关，一种表型可能有多个内型，而一种内型也可能有多个表型（见彩图1-7-3）。近年来哮喘内型研究已得到广泛关注，提出一些哮喘内型（表1-7-1，表1-7-2），且已有的临床试验发现依据内型治疗哮喘，可以提高患者对治疗的反应。

三、影响哮喘“内-表型”的因素或合并症

影响哮喘“内-表型”的因素或合并症有：①吸烟或二手烟暴露：通过增加中性粒细胞浸润和氧化应激改变既存的表型，可能是单独表型与COPD重叠。②体液因素：在体液因子变化期间发生哮喘（如初潮、怀孕、更年期等）；青春期性别差异导致哮喘发病率和患病率的不同；月经前哮喘恶化。③感染：在特应质儿童促发或增加Th2相关型哮喘；通过干扰素-β机制使哮喘恶化；可促发成人发作哮喘。④职业暴露：在易患个体促发哮喘，也可加重既存哮喘。

四、哮喘发病机制的研究进展

哮喘发病机制是哮喘内型的基础。哮喘发病机制的研究深受学者关注。20世纪90年代中期，对Th2免疫偏移在哮喘发病机制中的作用进行了广泛研究，发现Th1/Th2失衡是哮喘免疫学发病机制中的一个重要环节，Th2途径在哮喘的发病中起重要作用（见彩图1-7-4），是哮喘表型的重要基础，特别是儿童遗传性过敏性哮喘和成人轻度过敏性哮喘（图1-7-5）。以此为基础的抗炎治疗是近年哮喘治疗的重要突破，长期的临床实践证实了其有效性。

但随着研究的进一步深入，发现仅以Th2偏移不能完全解释诸多问题，如：气道高反应性（AHR）和气道重塑与气道炎症没有明确的联系；T细胞免疫抑制和新的Th2靶向治疗却非总是有效；用最佳的抗炎措施治疗，部分哮喘患者却总是迁延不愈；哮喘与COPD享有共同的遗传风险率；很多病人有反复恶化，某些病人总是很严重；同时Th2细胞炎症模型不能解释哮喘中已被证实的临床特征和分子机制的异质性的本质。进一步研究发现，哮喘发病机制中存在大量非Th2优势相关因素，哮喘的发作几乎都是各种因素之间复杂的相互作用的结果（见彩图1-7-6），各种因素之间的相互影响，产生了不同的内型。

非Th2优势哮喘在哮喘患者群中可能占有很大比例，但其分子机制非常复杂，涉及众多细胞和其组分（见彩图1-7-7），由此管控的相应表型还了解不够。一般认为轻-中度成人哮喘和无病史的儿童过敏可能属于这一类。以下是对非Th2优势哮喘机制研究的主要发现。

（一）黏膜屏障及其功能与哮喘的发病关系

气道黏膜的屏障功能障碍与哮喘发生有明确关系。有研究提示：由于先天性气道上皮间紧密联接不全，哮喘气道存在屏障功能缺陷，变应原进入气道组织变得更加容易，再加上变应原本身的生物学特性（具有蛋白水解酶活性），这一过程受到促进。此外呼吸道病毒感染和环境污染等因素也会损坏黏膜上皮的完整性。

进入气道组织的变应原通过经抗原递呈细胞（主要是树突状细胞，DC）激活Th2细胞，DC表面的TLRs所引发的信号转导促进了这一活化过程。黏膜上皮表达多种模式识别受体（PRR，尤其是TLRs），通过这些受体刺激上皮细胞释放多种趋化因子，细胞因子，经DC或nuocyte促发Th2反应。

研究认为先天免疫与更严重疾病和激素不敏感相关联，对哮喘病情和皮质激素敏感性有重要影响（图1-7-8）。如图示经典的Th2免疫在疾病的早期（蓝色）发挥作用，随病情加重，激素会变得更不敏感（红色），Th2免疫作用逐渐消失，但先天免疫的作用加大（黑色）。同时还显示2个新过程：A.通过活化巨噬细胞产生自身先天免疫，尤其是通过损伤相关分子模式（DAMPs）释放的因子活化局部先天性免疫；B.Th2样先天免疫介导的非T-细胞依赖过程。

（二）TLR受体的信号转导通路与哮喘

TLRs信号转导通路可以分为MyD88依赖性通路和MyD88非依赖性通路。前者是大多数TLRs利用的通路；后者是TLR3唯一能利用的信号通路，TLR4也可以利用这条通路。目前研究结果表明，TLRs在哮喘的发生发展中可能起着较为重要的作用，广泛分布在参与哮喘发病的免疫细胞上，参与宿主防御、调节免疫和诱导耐受，与哮喘的发生发展密切相关；哮喘与TLR单核苷酸多态性及其辅助蛋白相关联。有研究显示损伤相关分子模式释放出的内源性配体（如热休克蛋白等）可通过TLR经MyD88促进炎症反应，然而这种炎症反应对皮质激素不敏感。

肥大细胞在寄生虫免疫、过敏性疾病和哮喘发病机制中发挥重要作用。肥大细胞表面表达多种识别受体，包括Toll样受体（TLRs）。刺激这些受体使肥大细胞脱颗粒，分泌多种细胞因子、趋化因子和脂质介质。TLR信号转导与FcεRⅠ或c-kit信号相互协同，有可能提高肥大细胞对抗原的反应（图1-7-9）。

（三）树突状细胞（DC）和天然杀伤细胞与哮喘

DC是机体最重要的抗原提呈细胞（APC），在启动和维持哮喘免疫炎症反应过程中发挥重要作用。研究发现，在干细胞因子存在的情况下，抗原激活DC，通过c-kit受体信号通路诱导持续性IL-6、Th2及Th17细胞因子释放，参与哮喘的发生和发展。

新近研究表明NKT细胞也参与了哮喘的发生发展过程，是诱导产生AHR必不可少的，变应原和病毒等诱导的AHR都需要相应亚型NKT细胞参与；NKT细胞作为天然免疫和获得性免疫之间起“桥梁”作用的免疫调节细胞，被视为免疫治疗中最具有潜力的靶标。哮喘中NKT细胞的作用，在呼吸道病毒诱发的哮喘模型中得到进一步的支持。呼吸道病毒感染激活天然杀伤细胞，后者又激活巨噬细胞，并释放大量IL-13，促进黏液分泌和诱导产生AHR。

（四）巨噬细胞与哮喘

巨噬细胞作为IL-25/IL-33反应细胞，在诱导Th2免疫中发挥重要作用，参与哮喘的发生。IL-25/IL-33在体外刺激巨噬细胞产生Th2型细胞因子IL-5和IL-13；给予小鼠外源性IL-33或受线虫感染，则巨噬细胞成为IL-13产生细胞。IL-33诱导活化巨噬细胞主要通过自分泌IL-13激活IL-4Rα-STAT6通路。使小鼠去除巨噬细胞，可减弱IL-25/IL-33诱导的Th2免疫反应。因此巨噬细胞是Th2免疫反应关键而独特的先天免疫细胞群体，并可能成为控制Th2免疫反应介导炎症的潜在靶位。

（五）Th9与哮喘

Th9细胞分泌IL-9有第二Th2亚群之称，研究结果提示它作为一个特殊的T细胞亚群参与哮喘的发生和发展。目前认为，TGF-β和IL-4的存在是Th9细胞诱导分化的必要条件。对转基因或基因敲出鼠模型研究发现IL-9可直接或与IL-13协同刺激气道上皮黏液分泌，促进炎性介质释放与免疫细胞浸润，参与气道重塑，尤其是上皮下纤维化形成，与IL-4、干细胞因子协同刺激肥大细胞的分化发育。抗IL-9单抗的Ⅰ期临床研究已顺利完成，初步显示出其有效性。

（六）Th17与哮喘

研究表明Th17细胞与自身免疫性疾病有关，但在哮喘气道炎症的发生发展过程中发挥重要作用；Th17与Th2、Th1及Treg共同参与哮喘的发生，与气道高反应性、黏液分泌、气道重塑和激素抵抗性哮喘的发生均有密切关系。已有的动物模型研究为IL-17信号通路在重症哮喘发病中的作用提供了关键性证据（图1-7-10）。研究发现给予OVA激发小鼠抗原特异性Th17细胞可诱导肺泡灌洗液中性粒细胞增多和AHR，而且对糖皮质激素抵抗；然而给予抗原特异性Th2细胞可诱导肺泡灌洗液嗜酸性粒细胞和淋巴细胞增多，且对糖皮质激素敏感。这一结果支持在重症哮喘中Th17细胞介导糖皮质激素抵抗的中性粒细胞性气道炎症和AHR的观点。

（七）哮喘相关基因

近年来随着分子生物学和遗传学的不断发展，对哮喘相关基因的研究日渐深入，越来越多的哮喘相关基因被发现（表1-7-3），但很难在类似哮喘这样复杂性状中复制遗传关联，即使做基因连锁分析鉴定。

五、未来努力的方向

1.非Th2相关性哮喘研究还需进一步深化应用从哮喘人群基因组或蛋白质组研究所获信息开发新的实验动物模型，使之能更好地模拟哮喘病人的炎症环境。

2.动物研究应关注在非致敏或激发条件下感染、环境因素、肥胖和体液变化对哮喘的影响。

3.在无炎症条件下，气道高反应性小鼠的遗传学研究为哮喘患者相应的表型生物学研究提供线索。

4.应加强对严重哮喘分子标志的研究开发靶向治疗药物。

（吴昌归）

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