1-2　植物材料半薄切片

【实验目的】

1.了解半薄切片的原理；

2.掌握植物材料半薄切片的基本操作过程。

【实验原理】

半薄切片技术是以树脂作为包埋剂，用超薄切片机或石蜡切片机进行切片的技术。通过该技术得到的切片厚度一般在0.5～3μm之间，通常用于光学显微镜进行较细微组织的观察，或用于电子显微镜的初步组织定位。半薄切片的制备需要经固定、脱水、包埋、切片和染色等步骤。固定是指通过化学试剂迅速杀死植物细胞，使细胞中的各种细胞器及大分子保持原有生活状态，不发生位移。脱水的目的是将组织中的游离水彻底清除，便于后续包埋剂的渗入。渗透包埋过程是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外空隙被包埋剂填充。切片前通过修弃多余树脂，使样品暴露出来，截面大小在0.5mm2左右比较理想。切片分为安装样品块和切片刀、对刀、切片、捞片等过程。片子染色后便于在光学显微镜下进行细致观察。由于植物细胞具有细胞壁，部分组织具有致密的细胞结构，低黏度包埋剂Spurr树脂与传统的一些树脂相比，具有黏度低、渗透效果好、所需聚合时间短等优点，更适用于植物材料的包埋处理。

【试剂与器材】

一、试剂

1.FAA固定液（100mL）：37%甲醛溶液10mL，冰醋酸5mL，乙醇50mL，用ddH2O定容至100mL。

2.梯度乙醇溶液：分别将乙醇配制成浓度依次为50%，70%，80%，95%，100%的溶液。3.丙酮。

4.Spurr包埋剂：VCD树脂10g, DER7368g, NSA（nonenyl succinic anhydride）25g, DM-SA 0.3g，翻转混合30min，4℃聚合8h以上。

5.硼砂甲苯胺蓝染液：称取甲苯胺蓝1g，硼砂1g加100mL蒸馏水，溶解，过滤。

二、器材

真空泵，翻转混匀仪，制刀机，光学显微镜，半薄切片机，烤片台，烘箱。

三、实验材料

拟南芥叶片、根尖、水稻花序等。

【实验步骤】

一、固定

将材料放入FAA固定液，置于真空泵中抽气至材料下沉，4℃固定过夜。

二、脱水

将材料经过以下梯度浓度的乙醇脱水：

50%乙醇1h→70%乙醇1h→80%乙醇1h→95%乙醇1h→100%乙醇1～2h，重复换2～3次→丙酮1h，重复换2～3次。

三、浸透

将材料经过以下梯度过程浸透：

3/4丙酮+1/4 Spurr包埋剂8～12h→1/2丙酮+1/2 Spurr包埋剂8～12h→1/4丙酮+3/4 Spurr包埋剂8～12h→100%Spurr包埋剂8h，重复换3次。

四、包埋

先往模具中滴加适量新的Spurr包埋剂，将浸透完毕的材料小心包埋于其中，尽量使材料的纵向靠近模具两端，横向居中，沉底，再补加包埋剂至稍溢出，75℃聚合过夜。

五、切片

1.修块：削去材料表面的包埋剂，露出材料以方便切块。在材料四周以一定角度（一般与水平面呈45°，也可随材料性质大小灵活选择），削去包埋剂，侧面修成梯形，上窄下宽，防止材料块断裂，截面修成矩形或梯形，材料周围包埋介质应尽量修去。

2.制备玻璃刀（图1-2-1）：将玻璃条锯齿状花纹面朝下放置在制刀机上，截成2.5cm×2.5cm方块，此时每个方块的切开面有两个切迹，此切迹面朝左下，锯齿状花纹面朝右下，放在制刀机上，制成45°三角形切片刀。根据王文[4]等报道，右侧刀口为最佳玻璃刀口。

为了后续捞片方便，可以在玻璃刀刀口下方安装水槽接取切片。可以用专门与玻璃刀尺寸合适的塑料水槽，用石蜡固定在切口处；也可用胶带缠绕一圈，再用石蜡把接缝处封死（如图1-2-2）。使用前用滴管在水槽中滴满水。

（a）锯齿状花纹朝下放置；（b）切迹面朝左下，锯齿状花纹面朝右下；（c）左、中、右三部位刀口的切片效果

3.安装样品块和切片刀：按照切片机的要求，将样品块和玻璃刀牢固安装在切片机上，刀口和包埋块修块后暴露出的切面尽量平行。

4.对刀：对刀的目的是使材料达到最大的切面积。先粗调使刀与切面距离约0.5cm，确认切面是否与水平面垂直，再将刀与切面间距离调成近乎是一条细线，并左右移动刀座，粗略判定刀的左右高低，确定刀的使用方向。

5.切片：调好刀与材料块后，一般先在最左边刀口进行预修，以判断材料面是否切全及材料面的平整性，若切面未能切全，就将刀座稍向后移，再略调切面的垂直度，直到可以将切面切全。然后进行试探性预切，并随时镜检，以确定是否切到材料，切到材料后可再将刀座向左移动，用右侧刀口切出高质量的切片。

6.捞片：不使用水槽时，用细镊子小心夹取出切片；有水槽时，用镊子或细铜丝绕制的小铜网将漂浮在水槽中的切片捞出，在滴有水的干净载玻片上摆放整齐，100℃展片台上烤片至切片干透。

六、染色，观察

在载玻片上滴加硼砂甲苯胺蓝染液，100℃烤片10s，用水冲洗多余染液，烤干后在显微镜下观察、拍照。

【结果与分析】

在光学显微镜下由低倍镜向高倍镜寻找合适视野，观察植物较细微的组织结构。

【注意事项】

1.植物材料抽气一定要充分、彻底，否则会影响后续试剂的渗入。

2.植物材料在脱水过程中不可在高浓度酒精（＞70%）中放置过长时间，也不要在100%Spurr包埋剂中放置过长时间。

3.切片时要随时镜检，保证切到材料合适位置时切片的质量（无刀痕，切面完整，片子厚度适宜）。预切时可根据材料性质将切片厚度设置得稍厚一些（＞5μm），切到材料后再切出更薄的切片。捞片时镊子等用品不要碰到刀口，切片出现划痕时要立即更换玻璃刀。

4.拍照时，注意调节曝光时间及白平衡设置等，保证所有切片背景颜色、亮度一致，以便于观察比较。

【参考文献】

1.贺学礼.2004.植物学实验实习指导.北京：高等教育出版社.

2.李景原，王太霞.2007.植物学实验技术.北京：科学出版社.

3.叶创兴，冯虎元.2006.植物学实验指导.北京：清华大学出版社.

4.王文，蔡自力，杜开和.1991.超薄切片玻璃刀制作技术及使用方法的探讨.电子显微学报，（3）：307.

5.钟秀容，陈莲云，陈文列.1999.制备电镜超薄切片的技巧.福建医科大学学报，33（2）：224-225.

6.李新荣，魏丽，靳党英，等.1994.常规电镜标本制作方法的改进.郑州大学学报（医学版）（3）.