第二章　分子水平的检测技术

2-1　植物总RNA的提取及逆转录

【实验目的】

掌握RNA的提取和逆转录技术。

【实验原理】

在进行植物课题的研究过程中，无时无刻不用到RNA的提取和逆转录技术。

逆转录是提取出所需目的基因的mRNA，并以之为模板人工合成DNA的过程。逆转录酶的作用是以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA（主要是色氨酸tRNA）为引物，按5′→3′方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫作互补DNA（complementary DNA, cDNA），它与RNA模板形成RNA-DNA杂交体。随后又在逆转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成过程。

mRNA分子易被RNase降解，而RNase极为稳定且广泛存在，因此在提取过程中严格防止RNase的污染，并设法抑制其活性，是本实验成败的关键。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2h以上。凡是不能用高温烘烤的材料（如塑料容器等）皆需用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理，DEPC和RNase的活性基团——组氨酸的咪唑环反应，抑制RNase的活性。试验所用试剂也可用DEPC处理，方法为：加入DEPC至浓度为0.1%（体积分数），过夜涡旋振荡使之完全混匀，再用高压蒸汽灭菌以消除残存的DEPC。DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理，Tris溶液可用DEPC处理的水配制，然后高压蒸汽灭菌。配制的溶液如不能高压蒸汽灭菌，可用DEPC处理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。

【试剂与器材】

一、试剂

DEPC水：1000mLddH2O中加DEPC 1mL，配成终浓度为0.1%，用磁力搅拌器室温搅拌过夜，121℃高压处理20min以灭活DEPC。

二、器材

匀浆器、手术器材（剪刀、镊子）、恒温箱、金属浴、EP管、枪头（三种规格）、铝箔等。

【实验步骤】

植物总RNA的提取根据情况采用了TRIZOL提取法和试剂盒两种方法。

植物RNA提取试剂盒使用QIAGEN RNeasy Plant Mini Kit。

一、TRIZOL提取法

1.液氮研磨花序组织至粉末状，倒入1.5mLEP管中，加入TRIZOL 1mL。室温放置5min，使核蛋白复合物充分裂解。

2.4℃，12000 r/min离心10min以去除不溶的组织，吸取上清液入新管；加入氯仿0.2mL，充分摇动混匀，室温放置2～3min。

3.4℃，12000 r/min离心15min，吸取上层水相入新管；加入0.5mL异丙醇，室温放置10min以沉淀RNA。

4.4℃，12000 r/min离心10min，弃上清液；用预冷的75%乙醇洗涤RNA沉淀，4℃，7500 r/min离心5min。室温开盖放置以干燥沉淀。

5.加入适量无RNase的ddH2O溶解沉淀，即得到了总RNA。

6.消化RNA中混有的基因组DNA：取总量不超过5μg的RNA，加入DNaseⅠ（10 U/mL）1μL，37℃温育30min。65℃放置10min以终止反应并灭活DNase。最后得到的RNA于-80℃保存，或者直接进行cDNA的合成。

7.cDNA第一链的合成使用Invitrogen公司的SuperScriptⅢReverse Transcriptase试剂盒进行逆转录。操作方法如下：

（1）在无RNase的EP管中加入下列组分：

50μmol/L oligo（dT）：1μL；

10mmol/L dNTP：1μL；

植物总RNA：10 pg～5μg；

用无RNase的ddH2O补足体系至13μL。

65℃温育5min，冰上放置至少1min。

（2）再继续加入下列组分：

5×First-Strand buffer：4μL；

0.1mol/L DTT：1μL；

RNase抑制剂：1μL；

SuperScriptⅢRNase：1μL。

充分混匀后，50℃温育1h，70℃灭活15min。得到的cDNA于-80℃保存或直接用于下一步实验。

二、使用OMEGA植物RNA提取试剂盒提取RNA

1.收集植物组织，液氮研磨，后置于冰上，加入RB缓冲液500μL（用之前1mLRB加入巯基乙醇20μL），涡旋混匀。14000g室温离心5min。

2.吸取上清液放到gDNA filter Column中，14000g室温离心2min，用1.5mL无RNase离心管收集流出液。

3.在流出液中加入0.5倍体积的无水乙醇，上下混匀5～10次。

4.将上述液体加入RNA Mini Column中，10000g离心1min，倒掉流出液。加入400μL RWC洗脱缓冲液（wash buffer），10000g离心1min。

5.换一个干净的收集管，加入500μL RNA洗脱缓冲液Ⅱ，10000g离心1min（RNA洗脱缓冲液Ⅱ用之前加入一定量的无水乙醇）。重复一次。

6.倒掉流出液，放回收集管，10000g离心2min，完全消除无水乙醇。

7.换新的1.5mL离心管，加入DEPC水30μL，室温放置2min，10000g离心1min，洗脱RNA。RNA保存-80℃，避免反复冻融。

8.使用TOYOBO逆转录试剂盒（FSQ101）逆转录RNA，具体步骤如下：

（1）每管RNA中加入1μL无RNase的DNase，37℃孵育30min消化DNA，65℃15min使DNase失活。

（2）测RNA浓度。

（3）配制逆转录体系：

无核酸酶的水（Nuclease-free water）：nμL；

5×RT缓冲液（5×RT buffer）：2μL；

RT酶混合物（RT enzyme mix）：0.5μL；

引物混合物（primer mix）：0.5μL；

RNA：0.5 pg～1μg；

总体积10μL。

（4）37℃反应15min，98℃5min终止反应，将逆转录的cDNA保存于-20℃。

【结果与分析】

rRNA条带亮度一般表现为：28S＞18S＞5S，如果5S rRNA条带过亮，则说明RNA发生降解。

【注意事项】

1.RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解和防止所用器具及试剂中的RNase的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免说话等。

2.尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理：用0.1%DEPC水溶液处理12h，然后在120℃下高温灭菌30min以除去残留的DEPC（RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其他实验。）。

3.DEPC属于致癌物质，易挥发，要小心在通风橱中操作，高压蒸汽处理后会分解，其毒力消失。（用来泡器械的溶液不用高压蒸汽处理，用来配制试剂的溶液要高压蒸汽处理）。

【参考文献】

陈锐.2012.水稻雄蕊早期发育过程的全基因组表达谱研究.北京：北京大学生命科学学院.