实验8 园林植物组织培养技术
8.1 实验目的
①掌握培养基的化学组成和配方组成；熟练掌握常用培养基母液的制备方法和配制MS工作培养基的基本技能。
②掌握母液量取、培养基的配制与分装、扎口技术与灭菌方法。
③熟练掌握无菌操作技术和外植体的灭菌方法步骤。
④熟练掌握试管苗转接时的基本操作步骤；掌握试管苗扩繁的意义。
⑤熟练掌握继代无根苗生根培养基配制与生根苗移栽技术。
8.2 实验原理
①培养基的主要成分为水分、无机物质、有机物质、天然复合物质和凝固剂（或培养体的支持材料）。在植物组织培养中，配制培养基是基础性的工作。为达到准确称量和快速移取，以及便于贮藏等目的，生产上通常先配制成一系列的浓缩液，即母液。母液的浓缩倍数一般控制在10～100倍之间，根据成分的不同，可分为母液Ⅰ（大量元素）、母液Ⅱ（微量元素）、母液Ⅲ（有机物质，如维生素、氨基酸等）、母液Ⅳ（铁盐）和母液Ⅴ（激素类）五种。
②配制培养基时，按照标准配方和最终体积，依次量取各种母液放于容量瓶（或烧杯）中，再定容至最终体积即可。培养基的灭菌一般采用高温高压湿热灭菌法。基本原理是在密闭的锅体内，随着压力的升高，水的沸点也随之升高，从而大大提高水蒸气的温度。在121.3℃下，保持15～20min，能达到灭菌效果。
③植物外植体都是带菌的，在接种前必须进行消毒处理，杀死物体表面及其孔隙内的一切微生物，获得无菌材料后再进行组织养。
④初代培养获得的愈伤组织、胚状体和无根的芽苗等，数量有限，不能满足生根及实际生产上的需求。为了解决上述问题，可采用切割茎段法、切块法等方法，把初代培养得到的中间培养物转接在继代培养基上，使其继续增殖为新的中间产物，如此重复，就可以进行扩大培养。
8.3 仪器设备与用具
配制MS培养基所需药品、生长调节剂（2，4-D、NAA、IBA、6-BA）、托盘天平、电子分析天平、500mL烧杯、100mL烧杯、量筒（100mL）、定容瓶（1000mL）、各类移液管数只、蒸馏水、95%酒精、0.1mol/L NaOH、0.1mol/L HCl、棕色细口母液瓶、标签纸、电饭锅、琼脂、蔗糖、蒸馏水、三角瓶、记号笔、注射器、高压灭菌锅、超净工作台、75%酒精、盛有培养基的培养瓶、接种器械（主要指解剖刀、剪刀、镊子等）、酒精灯、0.1%的氯化汞（或漂白粉）、无菌水等。
8.4 方法与操作步骤
8.4.1 培养基母液的配制
见表1-8-1。
表1-8-1 几种培养基母液的配制
8.4.1.1 大量元素与微量元素培养基母液的配制
用电子分析天平称取大量元素，分别放入烧杯中，用少量蒸馏水溶解，在容量瓶中依次混合已完全溶解的药品；用电子分析天平准确量取微量元素和有机物质，分别放入烧杯中，用少量蒸馏水溶解后于容量瓶中依次混合溶解的药品。
8.4.1.2 激素类母液的配制
（1）称量
用电子分析天平准确量取激素类药品各0.1g（6-BA、IBA、NAA、2，4-D等）。
（2）溶解
生长素类（IBA、NAA、2，4-D）可先用少量0.1mol/L NaOH或95%酒精溶解；细胞分裂素类（6-BA）可先用0.1mol/L的HCl溶解。
（3）定容
将上述已完全溶解的各种激素溶液分别加蒸馏水定容至100mL，即成浓缩至1mg/mL的激素类母液。
8.4.1.3 母液的保存
（1）装瓶
将配好的各种母液分别倒入广口瓶中，贴上标签，写明培养基名称、母液编号、浓缩倍数、配制时间以及配制1L培养基时应该移取的量。
（2）储藏
将各母液瓶放入4℃冰箱内保藏。
8.4.2 MS培养基的配制
8.4.2.1 培养基的配制与分装
（1）量取母液
配1L MS培养基，按照母液顺序和所需量，用量筒和专一对应的移液管依次量取下列各母液于烧杯中：大量元素母液50mL；微量元素母液10mL；铁盐母液10mL；有机物质母液10mL；激素类母液按照需要设置不同浓度激素处理。
（2）熬制
另将预先称好的6～10g琼脂，加入约700mL水加热煮化。先用旺火烧开，再用文火煮溶，注意经常搅拌，防止糊底。琼脂熔化后将30g蔗糖加入锅中，然后将熔化后的琼脂倒入盛有培养基母液的烧杯中。加蒸馏水至刻度（1000mL），搅匀。
（3）调pH值
用pH试纸测试pH值，可用0.1mol/L NaOH或0.1mol/L HCI将其调到5.8左右。
（4）分装与扎口
将调好pH值的培养基分装到培养瓶内。100～150mL的三角瓶，每瓶装20～30mL的培养基。分装后立即扎紧瓶口。
8.4.2.2 培养基的灭菌
培养基分装完成后，应在24h内灭菌。灭菌过程如下。
①打开锅盖，加水至水位线。
②把已分装好培养基的三角瓶、蒸馏水以及接种工具等放入锅筒内，装锅时不要过分倾斜三角瓶，以防弄到瓶口上或流出。然后盖上锅盖，对角旋紧螺丝，接通电源加热。
③灭菌，培养基灭菌通常使用高压湿热灭菌法。即把包扎好的培养瓶放入高压灭菌锅中，进行高温高压灭菌。灭菌需在121～126℃高温、0.10MPa高压下持续20min，即可达到消毒灭菌的目的。
8.4.2.3 培养基保存
灭菌后的培养基从高压灭菌锅中取出，让其自然冷却凝固，根据需要可制成平面或斜面。制好的培养基最好在培养室中预培养3d，观察有无污染。暂时不用的培养基最好放在10℃左右的冰箱中保存。
8.4.3 外植体的灭菌
①在接种的前三天，用甲醛与高锰酸钾混合来给接种室灭菌，同时打开紫外灯照射30min。
②正式接种前打开超净工作台上的紫外灯和风机，杀菌20～30min再进行接种。
③用肥皂水清洗双手，在缓冲间内换好灭过菌的衣服和鞋帽，再进入接种室。
④用75%酒精溶液擦拭工作台面及双手。
⑤用75%酒精浸湿的纱布擦拭装有培养基的培养器皿，放进工作台。
⑥将解剖刀、剪刀、镊子等工具浸泡在95%酒精溶液中，在酒精灯的外焰上灭菌后放在器械架上待用。
⑦植物材料表面用消毒剂消毒。
a.预处理，在准备室将材料放在自来水下冲洗20min。
b.在无菌室把植物材料放进75%酒精中浸泡约30s后倒掉。
c.用0.1%氯化汞消毒5～10min，然后倒掉氯化汞。
d.用无菌水冲洗4～5次。
e.取出材料放在无菌纸上。
f.将材料剪成需要大小接到培养基上。
⑧操作过程中应经常用75%酒精擦拭工作台和双手；接种工具应反复在95%酒精中浸泡和在火焰上灼烧。
⑨接种完成后，清理和关闭超净工作台，打扫好灭菌室的卫生。
8.4.4 试管苗的转接与扩繁
（1）超净工作台灭菌
接通电源，打开紫外灯照射20min。同时打开风机20min。
（2）人员准备
洗净双手，穿上实验服进入接种室。在超净工作台内用酒精棉球擦拭双手、台面、接种工具、种苗瓶表面。种苗瓶要选择生长好、高达4cm以上的芽丛苗。
（3）转接
将酒精灯放在距超净台边缘30cm，正对身体正前方处。将种苗瓶放在酒精灯前偏左处，空白瓶放在灯前处，消毒瓶放在灯右侧，以方便操作；打开原种瓶，将瓶口过火一次，置于一定位置。剪刀和镊子灼烧灭菌后，用镊子将原种瓶内试管苗取出，放到无菌纸上，用剪子将其剪成1cm左右，带1～2个节及1～2个叶的小段，打开空白瓶，用冷却的镊子夹住小段迅速转接在空白瓶中，每瓶5～6个，接完后瓶口过火封口。
（4）注意事项
①每接完1瓶原种瓶后，再用酒精棉球擦拭双手一次，剪刀和镊子灼烧灭菌，以防交叉感染。
②转接结束后，将材料放在培养室内培养。7d后检查污染情况，及时清除。
8.5 生根培养与移栽
8.5.1 配制生根培养基（1/2MS培养基）
①按照各种母液顺序和规定量，用移液管吸或量筒取母液，放在烧杯中。
②加入生长素，加入量视培养物而定。
③称琼脂7g/L，加热熔化后加入白糖20g。
④将加热熔化后的琼脂倒入烧杯中，定容。
⑤将溶液的pH值用0.1mol/L的HCl或NaOH调至5.8。分装。
⑥灭菌锅灭菌20min。灭菌后取出待用。
8.5.2 无菌操作
①点燃酒精灯。用75%酒精擦台面、手、接种工具等。
②接种工具在酒精灯上反复灼烧。
③左手持培养瓶，右手持镊子将外植体送入瓶子。
④注意动作要快，不能说话，以防止污染。
⑤将接种后的生根培养瓶苗放入培养室。
8.5.3 试管苗驯化移栽
（1）炼苗
将生根的组培苗从培养室取出，放在自然条件下1～2d，然后打开瓶口，再放置1～2d。
（2）基质灭菌
将蛭石和珍珠岩分别用聚丙烯塑料袋装好，在高压灭菌锅中灭菌20min，灭菌后冷却备用。
（3）育苗盘准备
取干净的育苗盘，将蛭石和珍珠岩按1∶1混合，然后倒入育苗盘中，用木板刮平。将育苗盘放入1～2cm深的水槽中，使水分浸透基质，然后取出备用。
（4）试管苗脱瓶
用镊子将试管苗轻轻取出，放入清水盆中，小心洗去根部琼脂，然后捞出，放入干净的小盆中。
（5）移栽
用竹签在基质上打孔，将小苗栽入育苗穴盘中，轻轻覆盖、压实。待整个穴盘栽满后用喷雾器喷水浇平。最后将育苗盘摆入到驯化室中，正常管理。
8.6 作业
①简述各种母液的配制方法，说一说注意事项。
②简述MS培养基的配制程序，比较母液配制与培养基配制的难易程度。
③简述培养基灭菌的关键环节。
④接种7d后，观察接种材料的污染情况，并分析造成污染的原因。
⑤转接时如何才能减少污染？