第一节　化学修饰的方法学

着手蛋白质修饰工作时，首先碰到的是修饰剂和反应条件的选择，以期提高酶的某些特性，获得满意的修饰结果。修饰过程中要建立适当的方法对反应进程进行追踪，获得一系列有关数据。最后对得到的数据进行分析，确定修饰部位和修饰度，提出对修饰结果的合理解释，并进一步获得最佳修饰结果。

一、修饰反应专一性的控制

如果对与催化活性、底物结合或构象维持有关的功能基一无所知，那就只有通过反复试验去了解。在这样探索性的研究中，修饰剂及修饰反应条件的选择至关重要，直接影响修饰反应的专一性。

1.试剂的选择

试验目的不同，对专一性的要求也不同，因此，选择试剂在很大程度上要依据修饰目的。修饰的部位和程度一般可用选择适当的试剂和反应条件来控制。如果修饰目的是希望改变蛋白质的带电状态或溶解性，则必须选择能引入最大电荷量的试剂。用顺丁烯二酸酐可将中性的巯基和酸性pH下带正电荷的氨基转变成在中性pH下带负电的衍生物。如果要修饰的蛋白质对有机溶剂不稳定，必须在水介质中进行反应，则试剂应选择在水中有一定溶解性的。在选择试剂时，还必须考虑反应生成物容易进行定量测定。如果引入的基团有特殊的光吸收或者在酸水解时是稳定的，则可测定光吸收的变化或做氨基酸全分析，这是最方便的。用同位素标记的试剂虽较麻烦，但有其优越性。它可对蛋白质修饰反应进行连续测定，进行反应动力学的研究。试剂的大小也要注意。试剂体积过大，往往由于空间障碍而不能与作用的基团接近。一般来说，试剂的体积小一些为宜，这样既能保证修饰反应的顺利进行，又可减少因空间障碍而破坏蛋白质分子严密结构的危险。

一般地说，选择蛋白质修饰剂要考虑如下一些问题：修饰反应要完成到什么程度；对个别氨基酸残基是否专一；在反应条件下，修饰反应有没有限度；修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变；是否需要分离修饰后的衍生物；反应是否需要可逆；是否适合于建立快速、方便的分析方法等。在决定选择某一修饰方法之前，对上述问题必须有一个权衡的考虑。

用于修饰酶活性部位的氨基酸残基的试剂应具备以下一些特征：选择性地与一个氨基酸残基反应；反应在酶蛋白不变性的条件下进行；标记的残基在肽中稳定，很容易通过降解分离出来，进行鉴定；反应的程度能用简单的技术测定。当然，不是单独一种试剂就能满足所有这些条件。一种试剂可能在某一方面比其他试剂优越，而在另一方面则较差。因此，必须根据实验目的和特定的样品来决定使用什么样的试剂。

2.反应条件的选择

蛋白质与修饰剂作用所要求的反应条件，除允许修饰能顺利进行外，还必须满足如下要求：一是不造成蛋白质的不可逆变性。为了证明这一点，必须做对照试验。二是有利于专一性修饰蛋白质。为此，反应条件应尽可能在保证蛋白质特定空间构象不变或少变的情况下进行。反应的温度、pH都要小心控制。反应介质和缓冲液组成也要有所考虑。缓冲液可改变蛋白质的构象或封闭反应部位，因而影响修饰反应，如，磷酸盐是某些酶的竞争性抑制剂，因而该离子的结合可能封闭修饰部位。碳酸酐酶的酯酶活力能被氯离子抑制，因而修饰反应所用的缓冲液不应含有氯离子。

3.反应的专一性

在蛋白质化学修饰研究中，反应的专一性非常重要。若修饰剂的专一性较差，除控制反应条件外，还可利用其他途径来实现修饰的专一性。

（1）利用蛋白质分子中某些基团的特殊性　活性蛋白质特殊的空间结构能影响某些基团的活性。蛋白水解酶分子中的活性丝氨酸是一个很突出的例子。二异丙基氟磷酸酯（DFP）能与胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸作用，结果迅速导致酶失活。但DFP在同样条件下却不能与胰凝乳蛋白酶原及一些简单的模拟化合物作用。在蛋白质分子中特别活泼的基团，如上述活性丝氨酸在适当条件下只是其本身发生作用，而其他基团皆不作用，这种现象称为“位置专一性”，因为这是由它在蛋白质分子中所处的位置环境所决定的。

（2）选择不同的反应pH　蛋白质分子中各功能基的解离常数（pKa）是不同的。所以控制不同的反应pH，也就控制了各功能基的解离程度，从而有利于修饰的专一性。例如，用溴（碘）代乙酸（或它的酰胺）对蛋白质进行修饰时，试剂可与半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸的侧链及α-氨基、ε-氨基发生作用。当反应pH为6时，只专一地与组氨酸的咪唑基作用；当反应pH为3时，则专一地与甲硫氨酸的侧链作用。在这样的酸性pH下，比较活泼的巯基和氨基都以带质子的形式存在，而变成不活泼状态。

（3）利用某些产物的不稳定性　在高pH下，用氰酸、二硫化碳、O-甲基异脲和亚氨酸等，可将氨基转变成脲和胍的衍生物。虽然巯基也能与上述试剂作用，但因pH高，与巯基形成的产物迅速被分解。

（4）亲和标记　亲和标记是实现专一性修饰的重要途径。亲和标记试剂除了能与蛋白质作用外，还要求试剂的结构和与蛋白质作用的底物或抑制剂相似。因此，在作用前，试剂先以非共价形式结合到蛋白质的活性部位上，然后再发生化学作用，将试剂挂在活性部位基团上。这种方法在研究酶的活性部位时特别有用。例如，对甲基苯磺酰氟能作用于胰凝乳蛋白酶的活性丝氨酸上。

（5）差别标记　在底物或抑制剂存在下进行化学修饰时，由于它们保护着蛋白质的活性部位基团，使这些基团不能与试剂作用。然后将过量的底物或抑制剂除去，所得到的部分修饰的蛋白质再与含同位素标记的同样试剂作用，结果只有原来被底物或抑制剂保护的基团是带放射性同位素标记的。用这一方法可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。

（6）利用蛋白质状态的差异　有时在结晶状态下进行反应，可以提高修饰的专一性。例如，核糖核酸酶在晶体状态下进行羧甲基化时，反应主要集中在119号组氨酸上，对第12号组氨酸的修饰很少，两者之比为60:1。但在水溶液中进行同样的修饰时，两者之比为15:1，换言之，在晶体状态下羧甲基化反应的专一性比溶液状态下提高3倍。

二、修饰程度和修饰部位的测定

1.分析方法

测定修饰基团和测定修饰程度的实验方法在文献中已有详细的讨论。这里只能简述概况。用光谱法追踪检查最简单、最有用，而且还能很容易地计算出修饰速度。此法要求修饰后的衍生物具有独特的光谱或它的光谱与修饰剂的不同，但能符合这个条件的试剂不多。

最常使用的是间接法。被修饰的蛋白质经总降解和氨基酸分析后鉴定修饰部位。被修饰的残基经分离纯化后，可通过它含有的同位素标记量或通过有色修饰剂的光谱强度、顺磁共振谱、荧光标记量、修饰剂的可逆去除等来测定反应程度。测定一个被修饰氨基酸的出现，要比测定多个相同氨基酸中有一个消失更准确。理想的情况是被修饰的氨基酸在水解条件下是稳定的，而且在色谱图谱中有一独特的位置。使用蛋白水解酶降解，一般可避免不稳定问题。但有些修饰了的残基，即使在酶解条件下也不稳定，或者其他残基阻碍蛋白水解酶对临近肽键的进攻。这时常进行残基部位的第二次修饰，以产生另外一种更稳定的修饰。由第二次修饰的结果，可以得到第一次修饰的程度。例如，已经乙酰化的蛋白质再经二硝基苯酰化，然后酸水解，测定DNP-氨基酸和回收氨基酸的数目，再与总数进行比较，则能知道修饰程度。

2.化学修饰数据的分析

化学修饰中，可以测定许多实验参数，这些参数是与修饰残基的数目及其对蛋白质生物活性的影响相关联的。这里只介绍表示化学修饰数据的最常用的方法以及从这类数据分析中所能得到的信息。

（1）化学修饰的时间进程分析　时间进程分析数据是化学修饰的基本数据之一。如果修饰过程中有光谱变化，可直接追踪个别侧链的修饰。但常常是追踪修饰对蛋白质某些酶学参数（活性、变构配体的调节作用等）的影响来监测修饰过程。根据获得的时间进程曲线，可以了解修饰残基的性质和数目、修饰残基与蛋白质生物活性之间的关系等。时间进程曲线的测定实际上是蛋白质失活速率常数的测定。在大多数修饰实验中，修饰剂相对于可能修饰的残基是大大过量的，此时可以认为是假一级反应。从残余活力的对数对时间所做的半对数图可求出失活的速率常数。

若蛋白质中有两个以上的残基与活力有关，且与修饰剂的反应速率很不相同，则所得残余活力对数对修饰时间的半对数图为多相的。

有时修饰剂在修饰反应过程中本身又发生水解作用（如焦碳酸二乙酯），可先在同样条件下实验测定试剂水解的速率常数，然后再求出表观一级失活速率常数（Kobs）值。在修饰剂与靶蛋白不形成特殊复合物的情况下，Kobs对修饰剂浓度所做的图应为一直线，且通过原点。在有些例子中，如用亲和试剂修饰蛋白质时，在亲和试剂和蛋白质之间先形成可逆的特殊复合物，然后再发生失活作用。这时，由Kobs对试剂浓度作图，则得一双曲线。

（2）确定必需基团的性质和数目　蛋白质分子中某类侧链基团在功能上虽有必需和非必需之分，但它们往往都能与某一试剂起反应。长期以来，人们没有找到生物活力与必需基团之间的定量关系，也就无法从实验数据中确定必需基团的性质和数目。1961年，Ray等提出用比较一级反应动力学常数的方法来确定必需基团的性质和数目，但此法的局限性很大。

1962年，邹承鲁提出更具普遍应用意义的统计学方法，建立了所谓的邹氏作图法。用此法可在不同的修饰条件下，确定酶分子中必需基团的数目和性质。邹氏方法的建立不仅为蛋白质修饰研究由定性描述转入定量研究提供了理论依据和计算方法，而且确定蛋白质必需基团也是蛋白质工程设计的必要前提。感兴趣的读者可参考有关文献。

三、化学修饰结果

1.蛋白质功能改变

在确证试剂已经作用于蛋白质的基础上，除用物化方法（如旋光色散、圆二色性）验证修饰蛋白质在溶液中的构象是否发生了显著的变化外，还必须进一步证明，修饰作用是否发生在活性部位上，常用的方法有：

①如果修饰发生在活性部位或必需基团上，则蛋白质活性的丧失与修饰程度一定成某种化学计量关系（计算的比例关系），而且底物（或已确定是与活性部位结合的抑制剂）必然能降低修饰蛋白的失活程度，而与活性部位不能结合的分子则没有这种影响。

②当采用可逆保护试剂时，修饰失活的蛋白质随保护基的去除可重新恢复活力，而且活力恢复程度应与保护基去除量成一定的比例关系。

当然，修饰剂也可能修饰远离活性部位的氨基酸，结果使蛋白质构象发生改变，扰乱了活性部位的精巧结构，从而造成蛋白质活力丧失。引入带电基团或庞大基团时有可能出现这种情况。使用部位专一试剂则可避免这个弊病。酶经化学修饰后，一般活力要有所下降，但也有例外，如细胞色素C分子中5个氨基都用三硝基苯磺酸修饰后，导致活力丧失。但若用O-甲基异脲作用，将氨基转变成碱性更强的胍基时，却能增加其活力。这说明不是氨基本身，而是正电荷是它表现活力所必需的。修饰后酶活力的最适pH、对底物的专一性都可能发生改变，对金属的需要在性质和程度上也会有所不同。酶活力的改变可能是由于米氏常数的改变或最大反应速率的改变引起的，因此，应作适当的测量区分这两种现象。

2.修饰残基的不稳定性

原始修饰以后，还可能发生共价改变。如酰基转移、巯基转移、卤素转移及二硫键交换过程可能自发地或在纯化、降解过程中发生。蛋白质中的碘代酪氨酸相当不稳定，除对光和氧敏感外，在色谱过程中，或在弱酸性介质中，有碘离子存在时，能发生脱碘化作用。光氧化的组氨酸，经酸水解后，产生许多未知产物，但这些未知产物峰的位置与正常氨基酸的峰位重叠。

3.没有被发现的修饰

咪唑基、巯基、羧基甚至苯酚的酰化产物在反应条件下不稳定或在以后的纯化中被水解，因而检测不出。这种暂时性的修饰对构象的影响无疑会改变其他功能基的反应性和可接近性。C端的羧基能与一定强度的酰化剂作用，暂时形成混合酸酐，结果使羧肽酶不能除去C端残基。非末端羧基（特别是天冬氨酸的非末端羧基）也能产生环化亚酰胺和β-天冬氨酸肽键。

有些修饰反应不能检测出来，只是由于它们在蛋白质化学中不占优势地位，如汞盐常用于修饰巯基，但它也能裂解二硫键。色氨酸虽能形成各种络合物，并能进行加成反应，但由于修饰不产生显著的光谱变化，或因色氨酸的光谱常被酪氨酸光谱所掩盖，故从光谱上可能看不到修饰产物。