第三节　非水介质中酶的结构与性质

一、非水介质中酶的结构

传统酶学中，酶分子（固定化酶除外）是均一地溶解于水溶液中的。而在有机溶剂中，酶分子的存在状态有多种形式，主要分为两大类。第一类为固态酶，它包括冷冻干燥的酶粉或固定化酶，它们以固体形式存在于有机溶剂中。最近还有利用结晶酶进行非水介质中催化反应和酶结构的研究，结晶酶的结构更接近于水溶液中酶的结构，它的催化效率也远高于其他类型的固态酶。第二类为可溶解酶，它主要包括水溶性大分子共价修饰酶和非共价修饰的高分子-酶复合物、表面活性剂-酶复合物以及微乳液中的酶等。

酶不溶于疏水性有机溶剂，它在含微量水的有机溶剂中以悬浮状态起催化作用。按着热力学预测，球状蛋白质的构象在水溶液中是稳定的，在疏水环境中是不稳定的。近些年大量的实验结果表明，酶悬浮于苯、环己烷等疏水有机溶剂中不变性，而且还能表现出催化活性。为什么酶在有机溶剂中能表现出催化活性？许多学者对酶在水相与有机相的结构进行了比较，他们的实验证实了在有机相中酶能够保持其结构的完整性，有机溶剂中酶的结构至少是酶活性部位的结构与水溶液中的结构是基本相同的。如Andras Szabo等利用内荧光谱学和圆二谱学研究分析了溶剂诱导木瓜蛋白酶的结构变化情况，发现尽管在乙醇、乙腈浓度为90％时，木瓜蛋白酶的α螺旋的数量增多，但其整体三级结构没有明显改变。Maria Zoumpanioti等通过稳态荧光光谱的方法研究了酶与微环境的相互作用，通过荧光能量迁移的方法确定了不同分散相微环境中酶的定位，通过电子顺磁共振技术（EPR）研究了体系中水和有机相的界面性质，结果指出即使在低水含量的条件下，酶依然呈现出在高水含量下的结构状态。通过增加酶量的方式，作者还观察到当体系中水含量超过2％（体积分数）时，酶维持它的活性不变，此时它被定位在一个小“水池”中，阻止了有机相的破坏。Hiroyasu Ogino等通过圆二谱学对α-胰凝乳蛋白酶、嗜热蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的构象变化进行了研究，发现PST-01蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶在甲醇中的稳定性要远高于甲醇不存在时的稳定性。对聚氨基酸的构象变化的检测发现，在有甲醇和无甲醇的时候，聚氨基酸的二级结构有着不同的构象，作者进一步推测认为酶在有机溶剂中的稳定性可能与酶的二级结构的组成有着密切的联系。Teresa De Diego等在30℃和50℃检测了α-胰凝乳蛋白酶在离子液体1-乙基-3-甲基咪唑二（三氟甲基酰）酰亚胺中的稳定性，并与在其他液体环境（如水、山梨糖、1-丙醇）中进行比较。动力学分析指出，在1-丙醇的条件下，胰凝乳蛋白酶有明显的失活，而在3mol/L山梨糖和该离子液体存在的情况下，酶呈现出很强的稳定性。通过差示扫描量热法（DSC）、荧光谱学、圆二谱学分析，作者首次指出离子液体对酶的稳定性与蛋白质结构的改变有关。该离子液体相对于其他溶剂体系提高了酶的熔融温度和热容。荧光光谱清晰地表明该离子液体能有效地压缩α-胰凝乳蛋白酶的结构，防止出现在其他环境下常常出现的蛋白质展开现象。圆二光谱检测发现，在离子液体存在的情况下，β折叠片的结构增加到40％，这有效地反映出该离子液体对酶的稳定能力。酶在有机溶剂中结构的直接信息是从蛋白质在有机溶剂中的X射线晶体衍射研究中得到的。Fitzpatrick用2.3Å分辨率的X射线衍射技术比较了枯草杆菌蛋白酶在水中和乙腈中的晶体结构。发现酶的三维结构在乙腈中与水中相比变化很小，这种变化甚至比两次在水中单独测定结果的变化要小，酶活性中心的氢键结构仍保持完整。Yennawar等对胰凝乳蛋白酶晶体在正己烷中的X射线结构研究与Fitzpatrick得到的结果基本相似，即酶在有机溶剂中蛋白分子骨架的构象与水中相比没有明显的变化。目前晶体结构实验证据都支持酶在有机溶剂中蛋白质能够保持三维结构和活性中心的完整。但是有些作者也怀疑这是否是由于结晶的蛋白质比溶解状态的蛋白质更能抵抗有机溶剂的变性。

当然并非所有的酶悬浮于任何有机溶剂中都能维持其天然构象，保持酶活性。Russell将碱性磷酸酯酶冻干粉悬浮于四种有机溶剂（二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙腈和丙酮）中，密封振荡5h、20h和36h，离心除溶剂，冻干后，重新悬浮于缓冲液中，以对硝基苯磷酸酯为底物，测其酶活性，四种有机溶剂使酶发生了不同程度的不可逆失活。

Burke用固态核磁共振方法研究了α-胰凝乳蛋白酶在冷冻干燥、向酶粉中添加有机溶剂等过程中酶活性中心结构的变化，发现干燥脱水和添加有机溶剂冻干能破坏42％的活性中心，冻干过程中加入冻干保护剂（如蔗糖）会不同程度的稳定酶的活性中心结构。Klibanov等利用傅立叶变换红外光谱（FT-IR）研究了蛋白质冻干过程中的结构变化，发现冻干过程会诱导蛋白质二级结构的可逆改变，冻干过程增加了β折叠结构的含量而降低了α螺旋结构的含量。将蛋白质冻干的粉末或晶体放入有机溶剂并未使其二级结构发生明显的变化；而当将它置入水-有机溶剂的混合体系后，蛋白质的二级结构则发生了明显的改变。这种行为受动力学的控制。Burke等人的实验发现，7种有机溶剂导致0～50％的活性中心破坏，破坏程度与溶剂的疏水性相关。他们还发现，有机溶剂中酶分子构象部分破坏的原因还与溶剂的介电性有关，在高介电常数的溶剂中，随着溶剂介电常数的增大，酶分子构象将发生去折叠、分子柔性增加。有机溶剂能使酶分子部分地去折叠，但程度远小于冻干的过程。他们试图通过测定酶活性中心的变化，解释溶剂极性对酶活性的影响。但是他们的实验结果表明，不同介质中酶活性中心的完整性差别不大，而酶活性却相差4个数量级。因此，他们认为。酶分子活性中心的改变不是导致不同介质中酶活性变化的主要原因，酶分子结构的动态变化很可能是主要因素。

酶作为蛋白质，它在水溶液中以一定构象的三级结构状态存在。这种结构和构象是酶发挥催化功能所必需的“紧密”（compact）而又有“柔性”（flexibility）的状态。紧密状态主要取决于蛋白质分子内的氢键，溶液中水分子与蛋白质分子之间所形成的氢键使蛋白质分子内氢键受到一定程度的破坏，蛋白质结构变得松散，呈一种“开启”（unlocking）状态。北口博司认为，酶分子的“紧密”和“开启”两种状态处于一种动态的（breathing）平衡中，表现出一定的柔性（图2-1）。因此，酶分子在水溶液中以其紧密的空间结构和一定的柔性发挥催化功能。

Zaks认为，酶悬浮于含微量水（小于1％）的有机溶剂中时，与蛋白质分子形成分子间氢键的水分子极少，蛋白质分子内氢键起主导作用，导致蛋白质结构变得“刚硬”（rigidity），活动的自由度变小。蛋白质的这种动力学刚性（kinetic rigidity）限制了疏水环境下的蛋白质构象向热力学稳定状态（thermodynamic stability）转化，能维持和水溶液中同样的结构与构象。Broos J等用时间分辨荧光光谱（time-resolved fluorescence spectroscopy）研究了酶悬浮于有机溶剂中的结构特点，发现随着水化程度的提高，酶分子的柔性逐渐增加。Affleck用EPR技术，通过酶活性中心上连接的外源探针的运动比较了胰凝乳蛋白酶在不同介质中的动态结构。其实验结果进一步证实，随着溶剂介电常数的增大，酶分子的柔性增加。Deloof等用计算机模拟研究了有机溶剂中蛋白质动态结构和水化过程。MooreBD等采用NMR技术研究蛋白质柔性与酶活力的关系时，发现在完全无水的疏水介质中增加其他极性溶剂时，即使蛋白质的柔性不增加，酶也具有活力。因此，他认为在有机溶剂中酶分子的水合作用、蛋白质柔性和酶活力之间的关系要比过去人们的普遍认识复杂得多。

酶包埋在反相胶束中，可以在模拟体内环境的条件下，研究酶的结构和动力学性质。因为反相胶束是一种热力学稳定、光学透明的溶液体系，所以光谱学可以作为探测反相胶束中酶的结构、稳定性和动力学行为的一种灵敏技术。吸收光谱通常对生色基团周围的变化并不敏感，只是在测反相胶束中酶活力时有实际应用。圆二色性（circular dichroism）、荧光光谱（fluorescence spectroscopy）和三态光谱（triplet-state spectroscopy）通常用于研究胶束中的酶。圆二色性可以给出胶束中酶的二级结构信息。但是，有些表面活性剂分子在远紫外区有强的吸收，影响在190～240nm之间的准确测量。如十六烷基三甲基溴化铵的反相胶束不能在215nm下测量，因为溴有强烈吸收。为了测量圆二色性的变化，可用十六烷基三甲基铵的氯化物代替其溴化物。胶束中的水与大量水的性质不同，肽链接近表面活性剂分子的极性头可产生电场，这些是引起胶束中酶的结构变化的重要因素，因此，胶束中酶结构的变化取决于天然酶的结构和它在胶束中的水合程度。溶菌酶与反相胶束结合后，圆二色性发生变化，而乙醇脱氢酶和硫辛酰胺脱氢酶与反相胶束结合后，圆二色性几乎无变化。稳态荧光光谱只能给出荧光最大值的位置和变化。时间分辨荧光光谱可以测出荧光基团的动态详细情况。蛋白质中，报道最多的荧光基团是色氨酸。该方法用于反相胶束中几种多肽类激素和溶菌酶的研究，发现色氨酸残基的转动受到限制，限制的程度依赖于荧光基团是定位于内部水核还是邻近水-表面活性剂界面上。用荧光各向异性衰减方法在研究醇脱氢酶和反相胶束的边缘区域相互作用时，得到了色氨酸残基的快速运动和酶的整个旋转运动的信息。三态光谱可以很方便地测得反相胶束间的交换速率。Srambini小组将水含量从很小变到可能的最大值，测定了反相胶束中醇脱氢酶和碱性磷酸酶中色氨酸的磷光，证明色氨酸附近的动力学结构发生了变化。光激发的三线态可用作研究蛋白质和反相胶束表面活性剂之间的相互作用的探针，并用电子传递引起三线态猝灭，测定胶束间的交换速率。另一种测定非水介质中酶结构的方法是利用双亲分子增溶的方法。此种增溶方式不同于反相胶束，酶分子在这种情况下所处的微环境最接近于固体酶分子悬浮于有机溶剂中的情形，酶分子在有机溶剂中是均相的，能够对这种酶-表面活性剂复合物进行光谱分析。曹淑桂等人的实验结果表明，双亲分子氯化三辛基甲基铵（TOMAC）增溶的脂肪酶在非水介质中的荧光光谱与水溶液中的荧光光谱相比有很大不同，增溶酶在有机溶剂中的荧光光谱发生了明显的红移，而这种红移现象与增溶过程无关，是由于酶分子从水溶液抽提入有机溶剂后酶所处的微环境的改变造成的，也说明了酶分子在有机介质中的构象与水溶液中的构象不同。

二、非水介质中的酶学性质

酶在有机溶剂中能够保持其整体结构及活性中心结构的完整，因此，它能发挥催化功能，同时，酶催化反应时的底物特异性、立体选择性、区域选择性和化学键选择性等酶学性质在有机溶剂中仍然能够得到体现。但是由于有机溶剂的存在，改变了疏水相互作用的精细平衡，从而影响到酶的结合部位以及在很大程度上也会影响酶的稳定性和酶的底物特异性，另外，有机溶剂也会改变底物存在的状态。因此，酶和底物相结合的自由能就会受到影响，而这些至少会部分地影响到有机溶剂中酶的催化活性、稳定性以及选择性等酶学性质。

1.酶的催化活性和稳定性

（1）酶在有机溶剂中的催化活性　如果体系中没有水，显然对许多新的酶促反应是很有帮助的。例如，在水中有无数的脂肪酶、酯酶和蛋白酶能将酯催化水解为相应的羧酸和醇。在无水的溶剂中这些反应显然不能进行，但加入其他的亲核试剂，如醇、胺和硫醇，则可使新的酶促反应发生，即转酯化、氨解和转硫酯化反应，这些反应在水溶液中受到极大的抑制。此外，在无水溶剂中由醇和酸逆向合成相应的酯，在热力学上也变得十分有利。一般来说，酶在单纯的有机溶剂中所展示的活力远低于其在水相中的活力，但这种活力的下降也并非是不可避免的。

（2）酶在有机溶剂中的稳定性　对于酶的（热）不稳定性来说，有两种情况需要加以区分：一种是当酶暴露于高温时发生的随时间推移逐渐失去活性的不可逆失活；另一种是由热诱导的瞬间和可逆的协同性去折叠。但无论是哪一种失活方式，水在其中均起着非常关键的作用，包括促进蛋白质分子的构象变化、天冬酰胺/谷氨酰胺的脱氨以及肽键的水解等有害反应。所以，有机溶剂中酶的热稳定性和储存稳定性都比水溶液中高。Klibanov和Volkin认为有机溶剂中酶的热稳定性比水溶液中高的原因是由于有机溶剂中缺少使酶热失活的水分子，因此，由水而引起的酶分子中天冬酰胺、谷氨酰胺的脱氨基作用和天冬氨酸肽键的水解、二硫键的破坏、半胱氨酸的氧化及脯氨酸和甘氨酸的异构化等蛋白质热失活的过程难以进行。另外，酶分子的构象在无水有机溶剂中刚性增强，同时也没有水溶液中普遍存在的导致酶不可逆失活的共价反应。此外，水溶液中引起酶失活的另一个普遍原因——蛋白酶解，在有机溶剂中也不可能会发生，因为无论是混杂在制剂中的蛋白酶，还是可能成为酶解对象的其他酶（蛋白），均因不能溶解而无法相互作用。

2.酶催化的选择性

（1）底物特异性（substrate specificity）　和水溶液中的酶催化一样，酶在有机溶剂中对底物的化学结构和立体结构均有严格的选择性。例如青霉脂肪酶在正己烷中催化2-辛醇与不同链长的脂肪酸进行酯化反应时，该酶对短链脂肪酸具有较强的特异性，这与它催化三酰甘油水解反应时的脂肪酸特异性是相同的。但是，由于酶与底物的结合能取决于酶与底物复合物的结合能和酶、底物及溶剂相互作用能的差，因此，酶与底物的结合受到溶剂的影响。如胰凝乳蛋白酶等蛋白水解酶在水溶液中催化疏水的苯丙氨酸和亲水的丝氨酸的N-乙酰氨基酸酯的水解反应速率，前者比后者快5×104倍，而与水溶液中的结果相反，在辛烷中催化转酯反应时，丝氨酸酯比苯丙氨酸酯快3倍。在水溶液中组氨酸酯的反应活性只有苯丙氨酸酯的0.5％，而在辛烷中其反应活性比后者高20倍。其原因是酶在水溶液中，酶与底物的结合主要是疏水作用，而在有机溶剂中，底物与酶之间的疏水作用已不重要。酶能够利用它与底物结合的自由能来加速反应，总的结合能的变化是酶与底物之间的结合能和酶与水分子之间的结合能的差值。因此，介质改变时，酶的底物专一性和催化效率会发生改变。另外，底物在反应介质与酶活性中心之间分配的变化也是影响酶的底物专一性及其催化效率的因素之一，而底物和介质的疏水性直接影响底物在两者之间的分配。

（2）对映体选择性（enantioselectivity）　酶的对映体选择性是指酶识别外消旋化合物中某种构象对映体的能力，这种选择性是由两种对映体的非对映异构体的自由能差别造成的。有机溶剂中酶对底物的对映体选择性由于介质的亲（疏）水性的变化而发生改变，例如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、弹性蛋白酶等蛋白水解酶对于底物N-Ac-Ala-OetCl（N-乙酰基丙氨酸氯乙酯）的立体选择因子［即（kcat/Km）L/（kcat/Km）D的比值］在有机溶剂中为10以下，而在水中为103～104数量级。许多实验表明，疏水性强的有机溶剂中酶的立体选择性差，因此，某些蛋白水解酶在有机溶剂中可以合成D型氨基酸的肽，而在水溶液中酶只选择L型的氨基酸。一些研究者认为，有机溶剂中酶的立体选择性降低的原因是由于底物的两种对映体把水分子从酶分子的疏水结合位点置换出来的能力不同。反应介质的疏水性增大时，L型底物置换水的过程在热力学上变得不利，使其反应性降低很多；而D型异构体以不同的方式与酶活性中心结合，这种结合方式只置换出少量的水分子，当介质的疏水性增加时，其反应活性降低得不多，因此总的结果是酶的立体选择性随介质疏水性的增加而降低。Klibanov对有些脂肪酶也观察到类似的现象。他们还报道了枯草杆菌蛋白酶对映体选择因子（kcat/Km）S/（kcat/Km）R与介质的偶极矩和介电常数有良好的相关性，并且提出一个新的模型解释上述问题。他们认为在该酶活性中心底物结合部位有一个大口袋和一个小口袋，慢反应异构体是由于它的大基团与小口袋之间有较大的空间障碍，因此反应速率慢。任何降低蛋白质的刚性、减小空间障碍的手段都会提高慢反应异构体的反应速率。蛋白质的刚性主要是由于静电相互作用及分子内氢键的存在，因此，在低介电常数的溶剂中（如二氧六环）催化的选择性要高于高介电常数的溶剂（如乙腈）中催化的选择性。计算机模拟的结果也证实了上述实验结果。虽然上述模型能够解释反应介质对枯草杆菌蛋白酶对映体选择性的影响，但是它并不适用于所有的酶。例如，溶剂的疏水性对猪胰脂肪酶的对映体选择性的影响非常小，Candida cylindracea脂肪酶催化的2-羟基酸与一级醇的酯合成反应的对映体选择性与所用溶剂的lgP值也没有关系。

Ottolina报道溶剂的几何形状也影响酶的对映体选择性。如，一些脂肪酶和蛋白酶在（R）香芹酮及（S）香芹酮中的立体选择性不同。关于酶的立体选择性与反应介质的关系，有许多报道认为，增加体系的水含量会提高酶的对映体选择性。对此虽然并没有明确的解释，但是曹淑桂等认为，增加体系的含水量，在某种程度上可以使酶恢复其天然构象，快反应与慢反应的速率差加大，从而提高了酶的对映体选择性。

（3）位置选择性（regioselectivity）　有机溶剂中的酶催化还具有位置选择性，即酶能够选择性地催化底物中某个区域的基团发生反应。Klibanov用猪胰脂肪酶在无水吡啶中催化各种脂肪酸（C2脂肪酸、C4脂肪酸、C8脂肪酸、C12脂肪酸）的三氯乙酯与单糖的酯发生交换反应，实现了葡萄糖1位羟基的选择性酰化。当然不同来源的脂肪酶催化上述反应时，选择性酰化羟基的位置不同。因此，选择合适的酶，能够实现糖类、二元醇和类固醇的选择性酰化，制备具有特殊生理活性的糖脂和类固醇酯。目前对于酶在非水介质中的位置选择性研究得比较少。Rubion报道了P.cepacia脂肪酶催化图2-2所示的酯交换反应的速率V1与V2显著不同，反应的位置选择性因子（kcat/Km）1/（kcat/Km）2与溶剂的疏水性常数lgP有较好的相关性。为了解释这种现象，作者设想脂肪酶的活性中心附近有一个疏水裂缝，催化过程中如果底物a的辛基进入这个疏水口袋，那么丁酰基团就位于催化中心，形成产物b，如果丁酰基团位于疏水性口袋中，形成产物c。由于在疏水介质中，从热力学分析，辛基基团不易进入此疏水口袋，因此易生成产物c，而在亲水性溶剂中则相反。

（4）化学键选择性（chemoselectivity）　化学键的选择性也是非水介质中酶催化的一个显著特点。Aspergillus ninger脂肪酶催化6-氨基-1-己醇的酰化反应时，羟基的酰化占绝对优势，这种选择性与传统的化学催化完全相反。这样就可以在不需基团保护的情况下合成氨基醇的酯。Tawaki等发现反应介质对某些氨基醇的丁酰化的化学键选择性（O-酰化与N-酰化）有很大的影响。例如图2-3中化合物与丁酸三氯化乙酯的酰化反应在叔丁醇中和在1，2-二氯乙烷中的酰化程度不同。在Pseudomonas sp.脂肪酶的催化下，羟基更容易被酰化。有趣的是，在同样的溶剂中，Mucor meiher脂肪酶则更容易使氨基酰化，它对氨基与羟基的选择性差18倍。作者还观察到酶的化学键选择性与氢键参数有关，Mucor meiher脂肪酶催化羟基酰化时形成氢键的倾向强，而对于氨基酰化则刚好相反。作者认为，为了实现对酶-底物复合物中间体的进攻，亲核基团应该不易形成氢键，由于羟基基团易于形成氢键，因此不利于亲核进攻，氨基不易形成氢键，有利于亲核进攻，进行催化反应。

3.非水相酶催化的其他特征

酶在有机溶剂中一个非常有趣的性质是“分子记忆”效应，这是由于酶在无水环境中具有高度的构象刚性，结果导致酶在有机相中的性质变得与其历史有关。例如，将冻干的α-凝乳蛋白酶粉先溶于水，再用叔戊醇稀释100倍后，其活力比相同酶直接悬浮于含1％水的相同溶剂中的活力几乎高1个数量级。当再加入额外的水时，由于酶的结构变得柔顺，两种形式制备所得酶的差异将变小。

此外，将枯草杆菌蛋白酶从含有各种竞争性抑制剂的水溶液中冻干后，再用无水溶剂萃取除去抑制剂，然后再置于无水溶剂中催化时，与无配基存在下直接冻干的酶相比，不仅活力高100多倍，而且底物专一性和稳定性也明显不同。当酶重新溶于水时，这种配基诱导的酶记忆效应也随之消失。在给定的有机溶剂中，α-凝乳蛋白酶的对映选择性和脂肪酶的底物选择性，受到脱水过程中添加于酶水溶液中配基的显著影响。这些发现是比较容易理解的，如果假定这些配基会引起酶活性中心的构象变化，而且即使在配基除去后，所留下的“印迹（imprint）”在无水介质中也能保持下来。由于配基-印迹酶的结构有别于非印迹酶，因此它们的催化性质也不相同。