3.2 抗凝血材料的设计与合成

3.2.1 引言

随着人工器官、组织活性医用高分子材料和装置的迅速发展，医学界对生物医用高分子材料的抗凝血性要求也越来越高。凡是与血液直接接触的生物医用高分子材料，如人工心脏、人工血管、人工心血管的辅助装置及各种进入或留置血管内与血液直接接触的导管、功能性支架等医用装置等，都要求与血液接触后不引起血浆蛋白的变性，不破坏血液的有效成分，不导致血液的凝固和血栓的形成，即对材料的抗凝血性都有严格的要求。因而，如何提高生物医用高分子材料的抗凝血性是内植性高分子生物材料最为活跃的一个研究领域。

当血液在以内皮细胞为内壁的血管中正常流动时，一般不出现凝血现象。当高分子材料植入体内与血液相接触时，血液的流动状态和血管壁状态都发生了变化，材料被生物体作为异物而识别，两者界面将发生一系列复杂的相互作用，从而产生凝血现象。首先，小分子（水和无机盐等）和血浆蛋白（包括部分凝血因子、抗凝血因子）相继吸附在材料表面，形成蛋白质吸附层。材料的表面性质极大地影响着吸附蛋白层的数量、组成、结构，这对血栓的形成起重要作用。其次，吸附在材料表面的蛋白质变性、活化，在Ca2+存在的条件下，通过激活凝血因子、血小板粘附、红细胞粘附三条途径，最终导致血栓的形成。同时，由于生物体系还存在着抗凝血系统负反馈机制，如抗凝血因子体系、抗血小板体系、纤维蛋白溶解体系等，所以这些系统也会受到材料表面性质的影响，并与凝血系统协同作用，决定材料表面凝血反应的速率与程度。

材料与血液接触后，不形成不可逆的血栓过程，称为具有抗凝血性（Antithromboeicity）。依据材料表面的凝血机制，形成血栓的任何一个环节受到抑制或阻断，都可得到良好的抗凝血性。通常，材料的血液相容性可通过两种最基本的途径得到改善：一是设计生物惰性表面，尽可能削弱高分子材料表面与血液成分之间的相互作用；二是设计生物活性表面，有效调控高分子材料表面与血液成分间的相互作用。随着人们对血液凝固机制研究的不断深入，抗凝血材料经历了从普通的惰性材料到改性材料，从简单复合抗凝血活性因子到利用共价键或离子键等方法固定抗凝血活性因子，从非生物化表面到内皮细胞化表面等变化过程。就目前而言，抗凝血高分子材料的设计可概括为以下几个方面：①设计生物惰性表面；②设计生物活性表面；③仿生设计伪内膜化表面或内皮化表面；④设计液晶态表面。其中，液晶态高分子材料的设计及其血液相容性见本书第六章。

3.2.2 生物惰性表面的设计与合成

生物惰性表面包括聚氧乙烯醚（PEO）或聚乙二醇（PEG）化表面、微相分离结构表面和负电荷化表面。设计生物惰性表面的主要目的是减少血小板、纤维蛋白原或其他血液成分的粘附，或者不激活已粘附的血液成分，尽可能削弱材料表面与血液成分的相互作用。

3.2.2.1 PEO或PEG修饰表面

材料表面的亲水性及自由能与血液成分的吸附、变性等有密切联系。研究表明，极端亲水性表面的材料，由于界面自由能大大降低，削弱了材料表面对血液中多种组分的作用，因而呈现出优良的抗凝血性；而极端疏水性表面的材料，由于表面能低，与血液各组分作用小，同样可呈现优良的抗凝血性。因此，改变材料表面的亲/疏水性是提高材料抗凝血性的一个重要途径。而进一步的研究又表明，材料的抗凝血性并不简单地由亲水性或是疏水性决定，而是取决于它们的平衡值，这可能是由于具有亲/疏水平衡的材料与人体组织的天然水凝胶十分相似。

PEO或PEG是生物相容性良好的聚醚材料，具有高度亲水性、柔顺性的分子链，稳定的空间位阻效应以及在水溶液中较低的表面能。它一方面可与水结合形成水合PEO链，通过位阻排斥效应阻碍血液组分的吸附；另一方面，水合PEO的快速运动影响了血液—材料的微区流体力学性质，阻止了蛋白质在材料表面的停滞粘附与变性。因此，PEO被认为是阻止蛋白质的非特异性吸附和细胞粘附的最有效的亲水性高分子。通过在疏水性高分子材料表面物理吸附或共价接枝不同形态的PEO及其衍生物，材料表面可以构建一种长链亲水性钝化层，该钝化层能有效减少血浆中蛋白质和血小板在材料表面的粘附，并能减轻材料表面由非特异性吸附引起的各种不良反应，有效提高材料的血液相容性。如Sawhney等［1］将亲水性的PEO链吸附于海藻酸盐“—”聚（L-赖氨酸）药物缓释微囊表面，可降低微囊在体内引发排异反应的概率。然而，由于PEO的水溶性，简单的物理吸附往往不能保证PEO在材料表面的稳定性，所以将PEO接枝在材料表面、复合PEO的两亲性接枝或嵌段共聚物或采用表面截留法，可以提高PEO在材料表面的稳定性。如Han等在聚氨酯（PU）表面直接接枝PEG后，对改性表面进行纤维蛋白原和白蛋白吸附试验，结果表明，改性后的材料表面均没有检测到明显的蛋白吸附。Efremova等人［2］采用不同的接枝方法，在材料的表面接枝不同形态的PEG，从而降低了蛋白质和血小板在材料表面的粘附，大大提高了材料表面的抗凝血性能。计剑等［3］将两亲性十八烷基PEO接枝到聚氯乙烯膜表面，在利用PEO实现对非特异性作用阻抗的同时，通过末端的疏水性十八烷基原位诱导白蛋白在生物体表面进行组装，从而进一步抑制非特异性蛋白在材料表面的吸附。计剑等又通过原子转移自由基聚合方法（ATRP）合成了具有高密度多臂结构的双亲性梳状PEG（CPEG），然后用于聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）的涂层，涂层中的CPEG由于具有特殊的分子结构，其疏水主链可增强与基材的结合力，同时，其支链末端的羟基和PET表面的化学键合作用以及CPEG本身分子间或分子内的氢键作用可以使CPEG双亲聚合物在PET材料表面形成稳定的高密度PEG涂层。该涂层不仅可以有效阻抗血小板的富集和粘附，而且可以实现水溶性药物的表面固定和包埋释放。

Lee等［4］采用PEG-PPO-PEG三嵌段共聚物（Pluronic）与聚氨酯共混。与PEG相比，PEG-PPO-PEG具有两亲链段——中间一段PPO是憎水性链段，两端链段PEG是亲水性链段。改性后的聚氨酯材料表面的蛋白吸附和血小板粘附的试验结果表明，采用分子量小于10000的磺化PEG改性的聚氨酯表面具有明显的抗蛋白质吸附和血小板粘附特性，并且血小板粘附量随着磺化PEG聚合度的增加而逐渐减少，且当聚合度增加到80时，抗血小板粘附效果最好，几乎观察不到血小板粘附。这表明可通过改变憎水性的PPO和亲水性的PEG的相对链长来控制两亲性平衡，调节表面能，使表面性质有利于维持生物分子的正常构象。进一步将PEO三嵌段共聚物的端羟基磺化，结果在含较短PEO链段的共混物中，磺酸根的负电荷在抑制血小板粘附方面起主要作用；而在含较长PEO链段的共混物中，Pluronic分子链的活动性则起主要作用。Jiang等通过分子模拟研究发现，PEG的长链通过构象的弹性变化可以阻碍蛋白质吸附到材料表面，高表面密度和长链的PEG表现出较好的阻抗蛋白质吸附性能。

表面截留法是一种有效提高涂层稳定性的方法。截留法最早是由Hubbell等人提出的，其基本机理是利用一种溶剂或者混合溶剂，使基体材料充分溶胀，同时使改性材料溶解。基体材料和改性材料在这样的溶剂体系中作用一段时间后，在其中加入另外一种基体材料的不良溶剂，使基体材料表面迅速收缩，将改性材料分子截留在表面，形成一种表面互穿网络结构。表面截留法能够使亲/疏水性相差很大的两种材料结合起来，而且改性仅限于材料的表面。用这种方法改性的材料在基体材料的玻璃化转变温度以下都是稳定的。Hubbell等［5］利用截留法在PET膜表面固定PEO和聚乙烯基吡咯烷酮（PVP），从而提高了材料表面的亲水性，可有效阻抗非特异性蛋白吸附和细胞粘附。具体的实验方法如下：将PEO溶解于去离子水中，然后加入一定量的三氟乙酸；将PET膜浸入该溶液中，PET膜表面由于溶胀作用使得聚合物表面形成疏松的聚合物网络结构，柔性的PEO分子链自由扩散进入疏松的聚合物网络中；一段时间后，加入PET的不良溶剂——水，结果导致PET膜表面迅速收缩，PEO分子链被截留在PET的网络结构中，形成表面物理互穿网络结构。表面截留PEO后，聚合物膜表面的亲水性大大提高，蛋白质、成纤维细胞以及血小板的粘附大大减少。

目前，有关PEO改善材料表面抗凝血性能的理论有以下几种：亲水性理论、维持正常构象假说、熵变理论、排斥性体积理论、覆盖控制理论等。亲水性理论指出，由于PEO长链具有很强的亲水性，长链上能结合许多水分子，血液环境下血液成分如血浆蛋白质等与PEO长链的作用主要表现为水分子与水分子之间的相互作用，因而具有较好的抗凝血性。维持正常构象假说指出，血液接触性材料表面的结构应能维持血液中的生物大分子的正常构象不发生变化，否则就会因生物大分子（如蛋白质、血小板、细胞等）构象的改变而使其性质发生较大的变化，导致各种蛋白质和血小板吸附在材料表面，从而导致局部凝血现象的发生。但由于PEO的亲水性好，分子链的柔顺性高，对生物大分子呈现一种惰性状态，在相互作用过程中能够维持生物大分子原有的构象不发生本质变化，不易被生物大分子视为异物，所以能有效起到抗凝血的作用。熵变理论和排斥性体积理论认为，血液环境下PEO长链会伸展开来，当血液中的生物大分子靠近材料表面时，会压缩伸展的PEO长链使长链体系的熵变小于零，导致体系吉布斯自由能增加而变得不稳定，体系会恢复到原来能量较低的状态，从而使血液中的生物大分子如血浆蛋白远离材料表面；另外，在长链的高速运动效应下，PEO链段形成一片排斥性区域，绝大部分生物大分子被拒绝在此区域之外，有效地排斥了生物大分子，起到了抗凝血作用。覆盖控制理论认为，血浆蛋白质在材料表面的吸附由PEO改性后的材料表面所形成的微相结构控制，亲/疏水性不同的蛋白质会选择性地吸附在不同的微区，这种特定的蛋白质吸附层结构不会激活血小板表面的糖蛋白质，血小板的异体识别能力无法实现，从而阻碍凝血发生。

3.2.2.2 微相分离结构表面

生物体血管内壁从宏观上看是极其光滑的凝胶体，但在显微镜下可观察到血管内壁表面膜是一个双脂质的液体基质层，中间镶嵌了多种糖蛋白和糖脂质，这种宏观光滑、微观多相分离的结构使天然血管壁具有良好的血液相容性。

微相分离结构材料的开发是当前抗凝血高分子材料设计与合成的一个主要方向。所谓的微相分离结构，是指由两种或两种以上具有不同相容性和高分子链结构所组成的嵌段或接枝共聚物的某种特征微细结构的总称。这是一类微相不均匀结构，其中一相常以不同大小微区分布在另一连续相中，形成“海岛结构”。今井庸二于1972年首次报道了具有此种结构的材料具有优异的血液相容性。

微相分离结构材料具有良好的抗凝血性，Nakajima曾提出覆盖控制假说来解释其抗凝血机理。

聚氨酯（Polyurethane，PU）是指分子主链上含有氨基甲酸酯（-R-O-CO-NH-R`-）基团的聚合物，是一类典型的具有微相分离结构的高分子材料。通常，PU是由软段（长链的低聚二醇）及硬段（二异氰酸酯及扩链剂）所组成的线型嵌段聚合物，由于硬段具有很强的极性，硬段之间通过氢键形成硬段微相区，分布于软段基体中，形成一种物理性交联点，所以使弹性体具有硫化橡胶的弹性回复性能。PU分子结构中的软硬段存在着极性差异，从而具有微相分离结构，这种微相分离结构赋予PU良好的血液相容性。1967年，人们首次将聚醚型聚氨酯弹性体植入狗体内，4周后未发现凝血现象；同时，聚氨酯弹性体的力学强度也没有明显变化。这表明这类聚醚型聚氨酯弹性体兼有抗凝血性能和生物稳定性，是一种较为理想的血液相容性高分子材料。

为了进一步改善PU的血液相容性和机械性能，我们可将PU与其他组分制备嵌段共聚物，通过改变材料本体或表面化学基团的组成与分布来调控材料表面微相分离结构的大小与形态以及材料的力学性能，最终赋予材料优异的血液相容性和机械性能。如Majumdar等［6］将聚二甲基硅氧烷（PDMS）与PU制成共聚物，当PDMS含量为10%（质量分数）时，共聚物表面具有明显的微相分离结构，表现出良好的血液相容性。美国Cardiovascular公司生产的商品Cardiothane是聚氨酯与硅酮的嵌段共聚物，少量硅酮的引入对聚氨酯的抗凝血性能产生了巨大的影响。Cardiothane不仅保持了聚氨酯弹性体本身的良好性能，还具有非常优异的抗凝血性能，作为主动脉内反博气囊材料得到了很好的应用。

Takahara等还深入研究了聚醚软段的亲水性、分子量对聚醚型聚氨酯血液相容性的影响。他们分别采用聚乙二醇（PEG）、聚丙二醇（PPG）和聚四氢呋喃（PTMG）为软段，其中，聚醚材料表面的亲水性次序为：PEG＞PPG＞PTMG。材料的血液相容性试验显示，随着聚醚软段亲水性的增强，聚氨酯呈现最佳抗凝血性的聚醚软段的分子量下降。当上述三种聚醚软段的分子量分别为600、1000和1900时，对应聚氨酯材料表面上变形的血小板的数量最少。这表明聚氨酯的抗凝血性除了受嵌段的微相分离程度和微区尺寸影响外，也受其表面亲疏水平衡的影响。

目前，人们已相继研究开发了一系列商品化的聚氨酯生物医用材料，包括：Tecoflex（聚醚型，Thermedics公司）、Lycra®（聚醚型，Dupont公司）、Pellethane（聚醚型，Dow Chemical公司）、Tecoflex HR（聚醚型，Thermomedics公司）、Estane®（聚酯型，B.F.Goodrich公司）、Cardiothane（聚氨酯/有机硅杂化型，美国Cardiovascular公司）、Biomer（聚氨酯脲型，Ethicon公司）等。由于具有优良的韧性和弹性、良好的抗凝血性能，这些材料在人造心脏、人造心脏瓣膜、人造血管、血泵、助搏气囊等方面得到了广泛的应用。

3.2.2.3 负电荷化表面

由于血液中多种组分（如血红蛋白、血小板、部分血浆蛋白质等）在血液环境中呈负电性，血管内壁也呈负电性，所以一般认为表面带负电荷的材料因静电排斥作用可以阻碍血浆蛋白及血小板等物质的吸附，从而有利于抗凝血功能的发挥。因此，在材料表面修饰带负电性基团如羧基、磺酸根等来提高抗凝血性能已被广泛研究。程忠玲等采用戊二醛交联将褐藻藻酸双酯钠固定在丝素蛋白膜的表面上，由于褐藻藻酸双酯钠分子中带有呈负电性的硫酸基，从而有效提高了丝素蛋白膜的抗凝血性能。Ito等合成了带羧酸根基团的嵌段型聚氨酯，由于羧酸根阴离子的负电性，材料表面的纤维蛋白原和血小板吸附量及变形程度均明显减少。Han等利用聚氨酯材料表面上接枝的PEG链的端基引入了一个具有类肝素活性的阴离子磺酸基团（-SO32-），材料的血液相容性评价试验结果表明，由于兼有聚氨酯良好的抗凝血性能、PEG链的高度亲水性和柔顺性、磺酸根的负电性和类肝素的活性等特性，这种改性材料具有优异的抗凝血性能。然而，由于材料表面吸附蛋白质层及血液中阳离子的存在，仅依赖材料表面—血液相互间的静电作用来设计抗凝血材料具有一定的局限性。

3.2.3 生物活性表面材料的设计与合成

3.2.3.1 表面活性抗凝血材料的基本设计

生物惰性表面高分子材料虽然在体外或体内较短的一段时间内表现出良好的抗凝血性能，但由于高分子材料具有非平衡热力学（一般为松弛状态）等特性，而这种“生物惰性”属性并不是一成不变的，因此，理想的血液相容性高分子材料应具有抗凝血机制的生物活性表面。许多生物活性物质具有良好的抗凝血活性，通过物理吸附、共价键结合或离子键结合等将这些具有抗凝血功能的生物活性物质负载到材料表面，已成为设计抗凝血性高分子材料的主流。由于生物体内的血液凝固与抗凝血是一个相互制约的平衡过程，故设计抗凝血材料生物活性表面有两种思路：一是材料表面负载能够抑制血栓形成的活性物质如肝素、前列腺素、白蛋白、水蛭素等，其中以对肝素化高分子材料的研究最多，这类生物活性材料能够抑制多凝血酶原的活化，阻抗血小板粘附；二是材料表面负载能够溶解已形成血栓的活性物质如尿激酶、链激酶、纤维蛋白溶酶等，这类生物活性材料具有纤溶作用，可溶解材料表面已形成的血栓，其中，尿激酶和链激酶是临床常用的溶解血栓剂。第二类生物活性材料的研究相对较少，但纤溶在抗凝血方面的作用正日益受到重视，如泰尔茂和塞勒姆公司采用纤溶酶修饰聚酯弹性纤维编织管，从而制备了具有优良的抗血栓形成的人工血管。由于抗凝（阻止血栓形成）和纤溶（溶解已形成的血栓）是理想血液相容性材料的两个不可分割的重要方面，因此，也有人尝试将这两种活性物质集于同一高分子材料中，以制得一种同时具有抗凝血性和纤溶活性的新型血液相容性材料。

3.2.3.2 肝素类抗凝血材料

肝素（Heparin）是一种由葡萄糖胺磺酸、葡萄糖醛酸及艾社糖磺醛酸等组成的天然硫酸多糖类化合物，对血液有很好的抗凝效果，是临床上被广泛应用的抗凝血药物。在材料表面修饰肝素目前被认为是改善材料抗凝血性能最有效的方法之一。

Gott等最先报道了在人造石墨乳材料表面涂覆一层肝素能有效提高材料表面的抗凝血性能的研究。Thorslund等［7］在一种特定的中性、合适的闭合微系统中通过一步溶剂法在聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面均匀涂覆一层肝素，相对于未改性的PDMS材料表面，在相同条件下，改性后材料表面复钙化时间延长1 h，且没有纤维蛋白的粘附，显示出极好的抗凝血性能。Andersson等［8］制备的肝素——壳聚糖复合纳米级微乳不会引起血栓，是一种适合注射给药的理想载体。通过共混合物理吸附的形式将肝素与材料结合，有利于肝素生物活性的保持，但在溶液环境中，特别是流动的血液环境中，表面涂覆的肝素易流失而不能保证长时间的抗凝血活性。

近年，研究者们通过化学方法将材料与肝素共价结合，以提高肝素在材料表面的稳定性。如Kim等［9］利用化学接枝的方法将PEG引入PET表面，并将肝素固定到PEG末端来提高材料的血液相容性。Amiji等将肝素共价连接到壳聚糖膜表面，经过修饰的壳聚糖膜对血小板的吸附明显减少。Wang等将壳聚糖和肝素交联到聚（乳酸—羟基乙酸）共聚物（PLGA）表面，大大提高了PLGA的血液相容性；血小板粘附试验表明，表面经壳聚糖和肝素修饰的PLGA膜上几乎没有血小板粘附，而没有修饰的PLGA膜上则粘附了大量的血小板。Jee等［10］直接将聚乳酸与肝素反应，得到两端为肝素的功能化聚乳酸，并进一步将两端肝素功能化的聚乳酸涂覆在材料表面，这样可有效抑制蛋白质与血小板在材料表面的粘附。

然而，直接将肝素固定在材料表面会影响其抗凝血活性的充分发挥，这可能是由于材料表面束缚了分子的自由运动，改变了其具活性功能的正常构象而造成的。为此，在活性分子与材料表面之间引入一适宜长度的柔性间隔基（Spacer）可以克服这一不利影响，提高抗凝血活性。PEG分子链柔韧，亲水性好，且具有阻抗非特异性蛋白吸附等特性，是生物活性物质与材料表面连接最常采用的柔性间隔基。如Salchert等［11］将苯甲酰胺衍生物以羧基-PEG链为间隔臂共价接枝在马来酸酐共聚物表面，研究表明膜的厚度以及羧基的含量与共聚物的亲/疏水性及PEG的性质有关。苯甲酰胺对凝血酶的抑制作用与PEG的高亲水性、柔韧性和空间位阻效应协同作用，使得改性后的膜表面能高度结合凝血酶，使凝血酶失活，显示出极好的抗凝血效果。王安峰等首先在聚乙烯（PE）表面通过臭氧技术接枝甲基丙烯酸缩水甘油酯，再与具有不同分子量的双-（β-氨基乙基）PEG反应，生成端氨基化PEG间隔基，再通过端氨基偶联肝素。PE膜表面固定肝素后其抗凝血性能大大提高，且膜表面固定的肝素密度越大，材料的抗凝血性能越好。

有关肝素的抗凝血作用机理目前普遍认为与抗凝血酶III（AT-III）有关，因为肝素能够催化和增强AT-III与凝血酶的结合而防止凝血。对上述作用的解释目前有以下三种机理：一是肝素通过其分子上的羧基和磺酸基结合AT-III，诱导其构象变化而形成凝血酶/AT-III络合物，从而完全丧失了参与凝血的能力；二是肝素开始结合凝血酶，然后，AT-III再与肝素—凝血酶络合物相结合；三是AT-III与凝血酶同时结合到肝素分子上。其中，第一种机理目前被普遍认可。

肝素抗凝血功能主要是其大分子上的活性官能团即羧基和磺酸基协同作用的结果，因此，对材料表面进行羧基或磺酸基化，赋予材料合适的类肝素活性，也可有效提高材料的抗凝血活性。如冯桂龙等采用SO2等离子体处理丝素蛋白/胶原材料，从而在材料表面接上磺酸基团，而引入的磺酸基团在血液中表现出和天然抗凝血物质肝素类似的生物活性，可通过络合凝血因子干扰不溶性纤维蛋白网络的形成，促进凝血因子和抗凝血因子的结合以控制材料表面的凝血反应。屠美等以壳聚糖为原料，通过改性在其主链上引入-COOH和-SO3H两种基团制备成类肝素化合物，研究了反应过程中羧甲基和磺酸基取代度及不同取代位置对复钙时间和溶血率的影响。结果显示，合成的类肝素壳聚糖的抗凝血性能是由壳聚糖主链上引入的-COOH和-SO3H两种基团的协同效应产生的，血液相容性的优劣主要取决于-COOH和-SO3H两者的比例。汤顺清等通过反应在聚乙烯醇（PVA）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）纤维和聚醚氨酯（PEU）树脂表面引入磺酸基团，血小板吸附实验表明PVA和PET纤维及磺化后的PEU树脂吸附血小板的量明显减少，表现出类肝素的抗凝血活性。

3.2.3.3 其他表面活性抗凝血材料

白蛋白不仅能减少血小板的粘附和聚集，还可降低纤维蛋白原和血浆蛋白质的吸附。当生物材料表面的白蛋白相对纤维蛋白原占主导时，这种材料表面几乎能完全阻抗血小板的粘附［12］。因此，预先在生物材料表面涂覆或通过共价键结合一层白蛋白，形成血液相容性表面，能极大地降低纤维蛋白原和凝血因子等蛋白质的竞争吸附，从而显著提高材料的抗凝血性能。如Yamazoe等［13］利用天然白蛋白易溶于水、有效阻抗蛋白质的吸附和细胞粘附的特性，制备了一种不溶于水的白蛋白膜。该膜不仅有天然白蛋白阻抗蛋白质吸附的性能，还有一定的力学性能和柔韧性。细胞粘附实验表明，该膜表面没有细胞的粘附，能有效防止血栓的形成。Bayramoglu等［14］对肝素改性聚甲基丙烯酸羟乙酯［Heparin-coattd Poly（Hydroxyethyl Methacrylate），pHEMA-HEP］及肝素改性聚甲基丙烯酸羟乙酯——白蛋白复合物（pHEMA-AL-3-HEP）的生物相容性进行了比较。研究表明，复合了白蛋白的pHEMA-AL3-HEP的表面纤维蛋白原的吸附和血小板的粘附大大减少，抗凝血性能大大提高。这与白蛋白本身的抗血栓活性及白蛋白的添加增强了亲水性、缩短了HEMA聚合物的链长有关。Sperling等［15］通过层层自组装技术在PES铝箔表面涂覆肝素和白蛋白的多层膜，该膜有效减少了血小板的粘附/活化以及白细胞的粘附。

一氧化氮［NO，由血管内皮细胞中的一氧化氮合成酶（NOS）与L-精氨酸作用产生］是一种很好的血小板粘附或活化的抑制剂，健康血管的内皮细胞可以不断地释放出NO来防止血小板在血管壁上粘附，同时，NO也是一种重要有效的平滑肌细胞增生的抑制剂。因此，如果高分子材料能够在相当长的时间内，定点释放或者产生NO的量等于或大于正常的内皮细胞所释放出NO的量，就可以解决人工血管临床应用时易形成血栓及再狭窄的问题。

目前，可释放NO高分子材料的制备方法主要有三种：①通过物理共混的方式将小分子的NO供体（如L-精氨酸、多聚赖氨酸）分散到高分子材料中；②通过共价键将可释放NO的基团连接到聚合物主链及侧链上；③对聚合物材料的填料微粒进行化学改性，得到可释放NO的填料粒子，再将其填充到高分子材料中。例如，以L-精氨酸为底物，在NO合成酶的作用下，其胍基可释放出NO，从而起到抗血小板粘附和聚集的作用，这是一种潜在的抗血栓试剂。试验表明，通过在材料表面接枝L-精氨酸，可有效改善生物材料的血液相容性［16］。

Andukuria等［17］首先通过静电纺丝技术构建了具有相互连通孔洞结构的聚己内酯（ePCL）纳米纤维人工血管支架。为了提高ePCL人工血管支架表面的生物活性，他们又设计合成了兼有疏水性烷基尾链和亲水性功能化短肽序列［YIGSR——促进内皮细胞粘附；KKKKK（多聚赖氨酸）——NO的供体］的两种PAs（PA-YIGSR和PA-KKKKK），然后将PA-YIGSR和PA-KKKKK通过溶剂挥发自组装到ePCL纳米纤维支架的表面，从而制备出杂化纳米纤维人工血管支架。这类新型的杂化纳米纤维人工血管支架具有YIGSR配体，并且能够稳定释放NO，兼有良好的机械性能和拓扑结构，可以有效促进内皮细胞的粘附和增殖、抑制平滑肌细胞的粘附增殖以及形成良好的抗血小板粘附和活化等特性（如图3-1所示），有望在心血管植入材料方面得到很好的应用。

3.2.4 抗凝血材料的仿生设计与合成

对高分子材料表面进行仿生化修饰，使其不被血液视为异物，是一种最为理想的改善血液相容性的方法。仿生化研究主要有两种途径：一是仿生物膜结构——表面磷脂化；二是在材料表面种植、培养血管内皮细胞或赋予材料表面体内诱导内皮化的功能——表面内皮化。

3.2.4.1 材料表面磷脂化

细胞是具有生命功能的最小结构和功能单元。众所周知，血液中细胞的表面是完全抗凝血的，如果能在材料表面人工模拟血液细胞的表面，那么就能解决血液相容性问题，这就是生物膜模拟。仿生物膜表面设计的前提是要清楚细胞膜的基本组成与功能，图3-2为细胞膜的典型结构与基本功能的示意图。典型的细胞膜是以不对称双分子脂质层（主要是磷脂）为骨架结构的，中间镶嵌大量的生物分子如抗体、糖蛋白、酶、受体等。构成细胞膜的磷脂双分子层中，内层部分是疏水非极性长碳键的烃基，外层部分则是亲水的极性偶极离子，即磷酰胆碱（Phosphorylcholine，PC）基团，正是因为外层磷脂含有PC两性离子的极性头部而赋予了细胞膜优异的抗凝血性［18］。

进一步的研究表明，PC极性头部具有良好的抗凝血性能的机理是：一方面，含有PC端基的表面对血细胞是呈惰性的，不会吸附和激活血小板，也不会导致红细胞的溶血现象；另一方面，由于PC端基带有等量正、负电荷，可以与水分子形成非常牢固的水合层，减弱与蛋白的相互作用，对蛋白的吸附基本上为可逆吸附，因此被吸附的蛋白能保持其自然构象。据此，用PC基团及其聚合物对生物材料表面进行仿细胞膜结构的修饰，不仅能有效改善材料的血液相容性，而且可实现对包括蛋白质、血小板和细胞在内的非特异性阻抗，这已成为心血管植入材料表面修饰的有效手段之一。

日本学者Nakabayashi等最早提出了仿细胞膜结构的概念，设计合成了含PC基团的2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱单体（2-Methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine，MPC）及其与憎水单体的共聚物。MPC单体的分子结构如图3-3所示。

到目前为止，材料表面磷脂化仿生设计的主要方法仍然是以MPC为原料，通过与其他单体共聚将PC基团引入材料表面，赋予材料良好的抗凝血性能。如Ishihara等［19］合成了很多带有MPC的共聚物，将它们涂覆在基材表面，可以有效提高材料的抗凝血性能，如他们合成了MPC-甲基丙烯酸正丁酯和MPC-甲基丙烯酸正十二烷基酯的共聚物，将其与聚砜共混，提高了聚砜血液渗析膜的血液相容性。他们进一步合成了MPC-甲基丙烯酸异戊酯和MPC-甲基丙烯酸环己酯的共聚物，将其加入聚氨酯（PU）基材中，在很大程度上抑制了血小板和蛋白质的吸附。将这种PU共混物制成2 mm人工血管移植入兔子的大动脉，七个月后发现该人工血管仍工作正常，没有血液在血管中凝固。Lewis等合成了MPC、甲基丙烯酸月桂醇酯、甲基丙烯酸羟丙酯和甲基丙烯酸三甲氧基硅丙酯的共聚物抗凝血涂层。

Seo等［20］通过膨胀—溶胀方法在PDMS表面上接枝MPC形成ABA型嵌段共聚物，改性后的PDMS表面由疏水性变成亲水性，蛋白质吸附和细胞粘附能力显著下降，抗凝血性能大大提高。Xu等［21］采用臭氧活化接枝的方法把MPC接枝到硅橡胶膜上，接触角测定结果表明接枝后膜亲水性增强，富血小板血浆（PRP）实验和扫描电镜分析表明膜表面血液相容性显著增强，接枝膜在37 ℃下与PRP接触3 h未发现血小板粘附。

原子转移自由基聚合法（Atom Transfer Radical Polymrization，ATRP）可在温和条件下制备结构可控的新型聚合物，是目前应用最为广泛的一种活性自由基聚合方法。最近，沈健等采用ATRP方法首先合成了一种硅烷偶联剂大分子引发剂（PTMSPMA-Br），然后通过ATRP聚合方法，以PTMSPMA-Br大分子引发剂引发MPC聚合来合成PTMSPMA-b-PMPC两嵌段共聚物。这一新型嵌段共聚物中PTMSPMA段具有偶联基团，PMPC链段具有抗凝血功能。初步的实验结果表明，将该嵌段共聚物用于纤维素膜和硅橡胶膜的表面改性，经过改性后两种膜表面亲水性得到加强，同时抗血小板吸附性大大提高，即材料表面的抗凝血性能得到提高。

3.2.4.2 材料表面内皮化

材料表面内皮化是材料抗凝血性研究的新动向。内皮细胞（Endothelial Cell，EC）是血管内膜表面和血液之间的分界细胞。血管内皮细胞表面是最优良的天然抗凝表面，它不仅仅是一层物理屏障，而且在血管伸缩的调节、凝血纤溶系统平衡的维持以及免疫系统的调控等方面具有不可缺少的功能和作用，同时还参与机体的新陈代谢、能量运输和内分泌系统的调节。因此人们越来越认识到内皮细胞衬层在抗凝血中的作用。人们仿照天然血管，使内皮细胞和高分子材料杂化，即在材料表面培养内皮细胞，使其最终生长出一层内皮。这对于材料的血液相容性的改善，尤其是小口径人工血管的血液相容性的改善，将是一个极理想的途径。

1970年，Mansfield在涤纶（Dacron）人工血管上种植内皮细胞后将涤纶植入狗的动脉系统，3周后发现材料表面没有形成血栓。Herring等进一步证实了EC种植到人工血管材料表面可以形成完整的内膜，由此引导了人工血管内皮化的研究。实验是首先通过手术将狗的一段静脉取出，在无菌条件下把血管内皮细胞刮下来，经洗涤、离心及悬浮后再与血液混合灌入直径6 mm的Dacron人工血管，然后植入狗的动脉系统。手术4周后检查发现，内皮细胞化的人工血管表面70%的面积没有血栓，而纯Dacron人工血管表面无血栓的面积仅有22%。Whitehouse的实验同样也发现，Dacron人工血管植入体内8周后，内皮细胞化的材料表面无血小板粘附，而纯人工血管表面49%的面积上有血小板粘附。对弹性聚四氟乙烯（ePTFE）人工血管的研究也得到了相同的结果。人工血管的小口径在应用中保持良好的远期通畅率极其重要。Xia等［22］用PU作为小口径血管，血管表面种植EC使PU材料内皮化，形成抗血栓表层，既可以提高血管的通畅率，又提高了材料的血液相容性。另有研究者采用直径4 mm、长10cm的Dacron人工血管植入，手术后2周，发现内皮细胞化小口径人工血管的通畅率为70%，而纯人工血管的通畅率仅为27%，植入体内7个月后观察，内皮细胞化人工血管的通畅率达96%，而纯人工血管通畅率仅为29%。

目前，临床普遍采用的材料表面种植内皮细胞的技术有两种：

（1）一步法或沉淀法。人工血管手术植入前，将酶解法获取的自体内皮细胞与血液相混植入人工血管腔，细胞将沉淀、粘附到材料表面；然后将复合了细胞和血液的人工血管进行手术植入，使沉淀粘附于人工血管内壁的内皮细胞在体内环境中增殖，从而达到材料表面内皮细胞融合的目的。为了提高材料表面内皮细胞的种植量，Herring采用了二次沉淀法，即先往人工血管腔中注入部分获取的内皮细胞，孵育10 min，产生细胞的第一次沉淀；然后抽去管腔内的混合液，注入其余的细胞与血管相混，在缓慢旋转条件下于37 ℃的温度下再孵育10 min，产生内皮细胞的第二次沉淀，以增加内皮细胞在材料表面的粘附量，随后进行手术植入。

（2）两步法或融合法。该方法先将从自体获取的内皮细胞经体外培养传至2～3代，以增加细胞数量；然后将内皮细胞与血液相混注入人工血管腔内，于37 ℃、5%的CO2及旋转条件下培养3 h，再用细胞培养液进行融合培养7～10 d。待内皮细胞在人工血管壁表面融合成单层后进行手术植入。融合法保证了材料表面种植的内皮细胞的稳定性，从而不易被血流冲走，但不足是细胞体外培养时间长，易被污染。

目前内皮化技术的应用面临的主要问题就是EC与材料的粘附性不够，内皮细胞易被血流冲走，以及种植的内皮细胞活性低，不足以在材料表面形成一个融合的内皮细胞层等。进一步的试验表明，利用促进内皮细胞粘附的物质如纤维蛋白、纤维蛋白原或抗内皮细胞抗体是一种有效使内皮细胞和材料稳定结合的途径。

有效利用内皮化技术，不能仅仅局限于体外培养和种植内皮细胞，而是实现人工血管的体内内皮化。人工合成材料在体内不能内皮化的一个重要原因就是材料缺乏仿生特性，目前对此观点的认识较一致，也被众多的研究所证实。材料表面仿生特性可以通过在材料表面结合有关细胞、生长因子、基因等形成组织样基质，或在材料表面整合细胞外基质成分或接枝能与细胞结合的功能域结构等实现［23］。在仿生条件下形成的内皮细胞能有效阻抗纤维蛋白原的沉积和血栓的形成。因此，可以在表面自发形成内皮细胞或是内皮细胞能在其上粘附和增殖的材料将具有完美的抗凝血性能。

细胞外基质有助于细胞的粘附和增殖目前已经得到认同，因此，可以将细胞外基质主要成分如胶原、氨基多糖、蛋白多糖或细胞外基质成分中能与细胞特异性结合的一个功能域——短肽，如RGD，环状RGD［24］，Arg-Glu-Asp-Val（redv，具内皮细胞选择性）［25］，通过与细胞表面整合素的特异性识别实现特定的细胞粘附。内皮细胞在仿生的细胞外基质表面经3个月基本可分化成熟，因此可以有效降低血管再狭窄的发生概率。

另有研究表明，内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells，EPC）对体内构建内皮层发挥着关键性作用：Asahara等［26］于1997年首次在Science上报道了EPC，人体通过迅速动员外周血中的EPC，使体内局部损伤的内皮细胞快速得到修复，从而确定了EPC在血管内皮化中的关键作用和地位。为此，Kutryk将CD34抗体（特异识别EPC的整合素）共价接枝在不锈钢血管支架表面，通过抗原抗体特异结合的原理，将循环血中的EPC（表面表达CD34抗原）特异地捕获在支架表面，并随之在支架表面粘附、分化，形成光滑的内皮细胞层。动物实验结果显示，支架置入动物体内1 h后，包被CD34抗体的支架70%的表面被EPC所覆盖；48h后，包被CD34抗体的支架表面形成了完整的内皮细胞层；28 d后，抗体包被支架植入处的新生内膜增生明显轻于裸支架植入对照组［27］。

又如Joung等［28］首先通过静电纺丝技术构建了PU人工血管，并利用功能化聚乙二醇的端异氰酸酯基团与PU人工血管表面反应，从而制备了表面共价结合含端氨基聚乙二醇的PU人工血管，然后进一步利用聚乙二醇的端氨基将CD34抗体固定在PU纤维膜表面。体外细胞培养结果表明，CD34抗体的引入大大提高了EPC细胞在PU人工血管壁上的粘附、分化和内皮化，有效抑制了人工血管的内膜增生。在此基础上，可通过聚乙二醇的端氨基同时将CD34抗体和肝素共价结合到PU人工血管的表面，肝素的引入不仅可提高CD34抗体在PU人工血管表面的密度，而且有效抑制了人工血管腔内血栓的形成。这一研究结果表明，CD34抗体和肝素共同修饰的PU人工血管由于兼有EPC细胞分化特异性和优异的抗血栓性，有望成为一类理想的人工血管材料或血液接触性材料。具体的设计路线如图3-4所示。