1.2 实验内容与操作步骤

1.2.1 常用镜检方法

1．直接挑取检查

直接挑取检查适用于检查营养体和繁殖体产生在寄主植物表面（如赤霉病、白粉病、黑粉病、恶苗病等）的病原菌或经保湿、分离培养所得的病原物。具体方法是直接用针或镊子挑取少许病原物，放入加有一滴浮载剂的载玻片上，加盖玻片后，即可镜检。

常用的浮载剂是水或乳酚油（乳酚油配方：乳酸20mL，苯酚20mL，甘油40mL，蒸馏水20mL）。水作浮载剂的缺点是容易干燥，并易形成气泡。若将检查的材料先在70%乙醇溶液中放片刻，除去乙醇溶液后再加水作浮载剂，可除去气泡。用乳酚油作浮载剂制成的玻片不易干燥，可保存几天或更久一些，但乳酚油除易形成气泡外，另一主要缺点是使观察的实体变小。乳酚油中可加适当的染料染色。最常用的染料为质量浓度为0.5～1g/L的苯胺蓝（棉蓝）。苯胺蓝是酸性染料，可染真菌的原生质，而不染细胞壁。

制作永久玻片可将玻片经过乙醇溶液、苯酚或甘油脱水后，用中性树胶（苯酚+树胶）封固。

2．粘贴法检查

该方法适用于检查着生于寄主表面的病原物，如霜霉病、白粉病等。

（1）透明胶带纸粘贴

将胶带纸剪成1～2 cm长，贴在有真菌生长的部位上，病菌的孢子或孢子囊即粘在胶带纸上。然后将胶带纸撕下，放在滴有乳酚油的玻片上，上面再加一滴乳酚油，加盖玻片后，即可镜检。

（2）火棉胶粘贴

用玻璃棒将火棉胶液涂在有病原菌的部位，待干后将干膜剥下，放在载玻片上用95%乙醇溶液作浮载剂，加盖玻片观察。

3．组织整体透明检查

通过组织整体透明检查，我们不但可以观察植物表面的病原菌的形态，而且可以观察组织浅层内的病菌，如霜霉病、水稻黄化萎缩病、水稻叶黑粉病等。

（1）水合氯醛透明

将病叶的病斑剪成0.5～1.0 cm2，放入等量的乙醇溶液（95%）和冰醋酸混合液中，固定24h以上，然后取出病叶浸入饱和水合氯醛溶液中，待组织透明后取出，用水洗净，经稀棉蓝溶液染色，在甘油浮载剂中镜检。

（2）水合氯醛苯酚透明

将等量水合氯醛结晶和苯酚结晶混合，徐徐加热熔化，将上述叶片在混合液中浸至透明（约20min），然后镜检。

（3）乳酚油透明

将病叶的病斑剪成1～2 cm长，在乳酚油中加热，煮至叶片透明，镜检。

4．玻片培养检查

将在培养皿中已长出菌落的病原菌如水稻恶苗病等，在无菌条件下切成小块，移到无菌载玻片上，玻片放入无菌培养皿中保湿培养，2d后取出载玻片镜检，能看清分生孢子梗和分生孢子的着生情况。

5．徒手切片

此法适用于检查组织内部的病原菌。材料较大且较为坚硬的，可直接做徒手切片；对于细小柔软的材料，可夹在木髓、胡萝卜、马铃薯块中间切。徒手切片的具体方法是把待切材料放在小木块上，用手指轻轻压住，随着手指慢慢地往后退，将材料切成薄片，切下的薄片即放在盛有清水的皿中或载玻片的水滴中，用镊子挑选切得最薄并含有所需要内容的切片进行镜检。

1.2.2 真菌主要类群的一般形态观察

1．病原真菌营养体观察

使用解剖针挑取培养皿内腐霉菌和镰刀菌的菌丝。用水作浮载剂，制成临时玻片，先在低倍镜下后转高倍镜下仔细观察。注意两种菌丝体有无分隔（图1-1）、菌丝有无颜色，并同时观察腐霉菌的有性繁殖体——卵孢子，注意颜色和细胞壁的薄厚；观察镰刀菌的无性繁殖体——厚垣孢子，注意其细胞壁的薄厚和着生方式（顶生或间生，串生或单生）。

2．病原真菌营养体变态观察

（1）菌核

观察小核菌属的菌核切片。注意表层结构菌丝壁厚、色深、组织紧密；内层菌丝壁薄、色淡、组织疏松。再观察丝核菌属的菌核切片，菌核外有细丝与基物相连，内外颜色一致（图1-2）。

（2）吸器

观察小麦白粉病菌吸器玻片，注意伸入寄主细胞内佛手状的膨状体（图1-3）。

（3）假根

从培养皿中挑取根霉菌，观察孢囊梗基部的根状分枝，同时观察无性繁殖体孢子囊和孢囊孢子，注意囊轴的形态（图1-4）。

（4）根状菌索

观察木材腐烂病菌的根状菌索（图1-5）。

（5）子座

观察竹赤团子属的粉红色子座外形，并徒手切片观察结构。

3．病原真菌繁殖体观察

（1）无性繁殖体

1）游动孢子：注意腐霉菌的游动孢子从孢子囊中释放情况（图1-6）。

2）孢子囊和孢囊孢子：观察根霉菌的孢子囊和孢囊孢子（图1-4）。

3）芽孢子：观察啤酒酵母菌的示范镜（图1-7）。

4）粉孢子：观察白粉菌的示范镜（图1-8）。

5）分生孢子和分生孢子梗：挑取培养皿中或病标本的黑斑病菌霉状物，观察分生孢子和分生孢子梗的形态与颜色（图1-9）。

6）厚垣孢子：观察镰刀菌厚垣孢子细胞壁的薄厚和着生方式（顶生或间生，串生或单生）（图1-10）。

（2）有性繁殖体

1）卵孢子：观察腐霉菌的卵孢子。

2）接合孢子：观察示范片，注意孢子的颜色及表面突起。

3）子囊和子囊孢子：观察小麦赤霉病菌的子囊和子囊孢子，注意形态、颜色等（图1-11）。

4）担子和担孢子：观察蘑菇的示范片，注意担子和担孢子的形态特征（图1-12）。